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(無題) 削除/引用 No.13208-5 - 2026/01/29 (木) 05:15:34 - おお >電気泳動についてもほとんど見えないというのは情報として不正確です。 このことはちょっとふれようとしたのですが、 マーカーは多分見えていると思われますがどうでしょう。 マーカーは大抵のメーカーで各バンド何ng含まれているとか明記してます。それと比較して一度収量を見積もってみてください。まあそれでも200ng/ulならマーカーよりはかなり強いバンドが見れるでしょうから、感覚としては少ないというのはそうなのかもしれませんが。染まり具合、カメラの自動調整などで毎回結構印象が変わるということもあるので、いつもそういう意識を持っていたほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.13208-4 - 2026/01/29 (木) 04:43:03 - おお miniprepはキットを使わない方法でもそんなに手間がかからないのでプレートが残っていれば２、３クローンキットに頼らずプラスミドを抽出してみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.13208-3 - 2026/01/28 (水) 10:18:37 - seventh nanodropの波形をきちんと確認したほうがよいです。 260nmがピークになっていますか？ 230nmは谷になっていますか？ 260/230、260/280の比率はどうですか？ コンタミを疑うところですが、情報が不十分で何が原因で正確な濃度が出ていないのか推定できません。 電気泳動についてもほとんど見えないというのは情報として不正確です。 ターゲットらしきものが見えているなら菌株としては問題ないと仮定して、後段の培養か精製を疑うところです。 また、ターゲット以外に何が見えているか（もしくは何も見えないか）も重要な情報です、

(無題) 削除/引用 No.13208-2 - 2026/01/28 (水) 04:01:31 - おお Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification Systemのトラブルシューティングをまず読んでみてください。すぐに思いつくのはグアニジンが抜けきれずコンタミしている可能性です。２３０nmの吸光度でわかるかもしれません。ただし複数のコロニーでそうなら別の要因の可能性もあると思います。そのキットで別のプラスミドで精製できてますか？ >もう1点は、70ng/ul x 100ul程度のプラスミドをフェノールによる除タンパク質→エタノール沈殿を行うと、その後の収量が50%以下になってしまいます。 個々の事例においてどのような状態のサンプルとか色々あると思いますのでなんとも申し上げられません。 考えられることを羅列しますと、 RNA（非常に短くて電気泳動で検出しにくいレベルでも）がコンタミしていて、それがいくらか除けたため。徐々に分解していっていると考えればエタ沈だけでも分解産物が除ける。 そのDNAサンプルがクルードあるいは２６０nmの吸収をもつ物の共存などで最初の見積もりが不正確だった。 フェノクロのときのロス。フェノクロ処理後水層の何％ぐらいが回収できてますか？たとえば５０μlのサンプルに５０μlのフェノールを加えたときマイクロチューブで結構ロスがあるように思えます。私はマイクロチューブでやるときはサンプル：フェノール＝３：１ぐらいでロスを防いでいます。チューブが先細りなので同量あっても水層は高さ（深さ）がなくロスが大きいと思えるので。 RNA用の酸性フェノール（pHを調整していないフェノール）を使っている。酸性フェノールはDNAの溶解度が高いので。 DNAが徐々に分解している。 経験的にはあまりないのですがフェノールが劣化している。 ちなみにフェノール処理のあとクロロフォルムでフェノールを除いてますか？

プラスミドの精製とエタ沈 削除/引用 No.13208-1 - 2026/01/27 (火) 18:56:29 - k いつも勉強させていただいております。 2点質問がございます。 現在、プラスミドのクローニングを行っているのですが、miniprepでプラスミドがうまく精製されません。 nanodropで濃度を測定すると、200ng/ul程度あるのですが、それを泳動してもバンドがほとんど見えません。 何が起こっているのでしょうか。 条件は以下の通りです。 1．DH5aをヒートショックで形質転換。 2．LB寒天培地で37℃一晩。 3．コロニーを5mlのLB液体培地に懸濁し、37℃一晩振とう。 4．ペレットにし、Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification Systemで精製。 抗生剤があっていることは確認しています。 もう1点は、70ng/ul x 100ul程度のプラスミドをフェノールによる除タンパク質→エタノール沈殿を行うと、その後の収量が50%以下になってしまいます。 エタノール沈殿は、酢酸ナトリウムと100%エタノールで行っております。 ご意見いただけますと幸いです。 よろしくお願いいたします。

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