>[Re:1] Atailさんは書きました :
> 初歩的な実験手法に関する質問で恐縮です。MEFで細胞分画を行ったところ、（１）tublinが核分画に多くコンタミ、（２）核マーカーであるヒストンのバンドがものすごくラダリングしている、という問題が起こりました。ボスがMEFで同じ実験をした時にも「bad feelingがした、うまくいっていない気がする」と言って、やはり同じ問題が見られました。分画は以下の方法で行いましたが、293Tではうまく行きました。
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> １）0.5mM PMSF入り低張バッファで細胞を膨潤後、1% Triton-100を添加。30%程度の速度でgentlyに30秒vortex。
> ２）1400xg, 1min遠心し上清をサイトゾルとして回収。
> ３）微妙に残ったサイトゾル溶液をは、核ペレットを吸うか吸わないかぐらい攻めて完全に取り除く。粗核画分のwashはしていない。
> ４）核をRIPAで懸濁、15秒程度の超音波破砕後に上清を回収。
ヒストンについて何がおこっているのかよくわかりませんが、、、分解なのでしょうかそれとも修飾、あいそふぉーむなどのバリエーションなんでしょうか。細胞の調子はもんだいなかったのですよね。トータルライセーとと比較すると分かるかもね。
核はwashしてもいいかと思います。わたしなら、でタージェンとフリーのバッファーに再けんだくしてあらいますけど。
tubulinはグリセロールがあるとポリマーとして安定しますのでもし入っていたら抜いてみてはどうかとおもいます。
細胞が破裂しているかどうかは顕微鏡で観察して確認するといいかとおもいます。これはきっちりとした方法論を書いているものにはそういうふうに書いているので調べてみるとよろしいかと。
>（２）は、DNA破砕が不十分なためでしょうか。何かコツや良い方法などがあればご教授頂ければと思います。
そうは思えないですけど、、、ちょっと実際データーを見ないとなんともいえません。
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> それと、文献を探していたところ「REAP:２分で分画！」という方法を見つけました。
> http://www.biomedcentral.com/1756-0500/3/294
ていちょう液を使ってないので、核成分が一部不安定な状態になっている可能性があります。何をやるか、見るかによっていいかどうか変わってくるのではないかとおもいます。 |
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