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(無題) 削除/引用 No.13187-9 - 2025/12/19 (金) 14:32:55 - sksho >mpさん こんなにも僕の実験に向き合っていただき、ありがとうございます！ ヘパラン硫酸欠損細胞を使用したことはないのですが、KDした細胞でのデータはあります。その際は、目的のデータ（感染率が目的通り阻害される。もしくは感染率が一定になる）が得られています。 希釈していないウイルスでの実験はうまくいくので、そこを手がかりに欠陥を探しているのですが、なかなか難しいです... ウイルスが含まれている培地の持ち込みが重要なのかもしれないですけど、こんなにも複雑な実験系だとは思っていなかったです...

(無題) 削除/引用 No.13187-8 - 2025/12/18 (木) 19:26:37 - mp 実験に使いたいアッセイ系自体がワークしないとなるとなかなか大変ですね。例えばヘパラン硫酸欠損細胞（一般的にはEXT1 KOなど）でもウイルスAはWTと同程度感染しますか？ヘパラン硫酸依存性をアッセイ系の指標にするなら、ヘパリン阻害の代わりにKO細胞を使うのも手かと思います。

(無題) 削除/引用 No.13187-7 - 2025/12/18 (木) 14:06:46 - sksho >mpさん 鋭いアドバイスありがとうございます。 プルダウン実験をやったことはないですね。ただ、私が今やっている実験はすでに出ている論文と全く同じこと（再現）をやっておりまして、その論文ではウイルスAは「HS感受性はない」となっているのですよね（ヘパリン中和試験のデータも感染率が一定になっているので、私の実験のどこかに不備があるのかと思っています）。 答えになっているか微妙ですが... ヘパリンを入れた途端に感染率がおかしくなってしまうため、ヘパリンが悪さをしていることは明らかなのですが...。1%BSAを入れたり、FBS濃度を変化させたりして変化があるかも試しているのですが、感染率が一定になることはないです。 ただ、興味深いことに、いつもはウイルスを希釈して使用しているのですが、他のtiterの低くて原液を使用するウイルス（HS感受性なし）はしっかりと一定の感染率のデータが得られます。 謎は深まりますね...

(無題) 削除/引用 No.13187-6 - 2025/12/18 (木) 11:40:00 - mp 例えばヘパリンビーズを使ったvirionのプルダウン実験などでも差はありますか？実はウイルスAもヘパラン硫酸結合性はあるけど、感染にはいらない、ただ初めにウイルスにヘパリンをまぶしてしまうと、本来の受容体に結合できなくなるとか？

(無題) 削除/引用 No.13187-5 - 2025/12/18 (木) 11:04:20 - sksho >mp様 ご回答ありがとうございます。 ウイルスの継代回数も念頭に置きつつ実験を行なっており、他の性状解析ではヘパラン硫酸依存性あり/なしで有意差がみられているので、HS依存性には問題がないと思っております。（passage回数が同じものを使用しております） 他の実験ではヘパラン硫酸依存性あり/なしの有意差がみられているのにも関わらず、ヘパリン中和試験のみうまくいきません。。。 このアッセイ系をベースに実験を進める予定なので、トラブルシューティングをしなくてはいけなくて。。。

(無題) 削除/引用 No.13187-4 - 2025/12/18 (木) 11:00:19 - sksho >おお様 ご回答ありがとうございます。 ヘパリン溶液に関しては、同じもので同じ調製方法で使用しております。 しかしうまくいっておりません。。。 少し塩などを入れるといいのですかね。。。

(無題) 削除/引用 No.13187-3 - 2025/12/18 (木) 10:34:00 - mp ウイルスAが継代の過程で、感染がヘパラン硫酸依存性になっている可能性もゼロではないです（ウイルスの継代ではよくあること）。使っているウイルスの由来、継代回数などはどうでしょう？

(無題) 削除/引用 No.13187-2 - 2025/12/18 (木) 06:42:06 - おお ヘパリン溶液のpHは？硫酸基という強い酸性基を持ちますので。先行研究と同じ商品、同じ調整法でやってますか？

ウイルスのヘパリン中和試験がうまくいかない... 削除/引用 No.13187-1 - 2025/12/18 (木) 04:45:34 - sksho ウイルスのヘパリン中和試験について、質問させていただきます。 ウイルスA（ヘパリン依存性なし）とウイルスB（ヘパリン依存性あり）において、それぞれヘパリン溶液とウイルス液を混合し、ヘパリンをウイルスに吸着させたのちに、細胞に添加する。その後、細胞をwashし、培養。その後、IFAで感染率（阻害率）を測定する。 といったような手順で実験をしています。阻害されるべきウイルスBは濃度依存的な感染阻害が見られています。一方で阻害がされないウイルスAはヘパリンを入れていないコントロールと比べ、低濃度でもヘパリンを入れると、阻害が見られてしまいます（低濃度から高濃度にかけて感染率は一定。コントロールのみ感染率が高い状態）。 理想はウイルスAは全てにおいて感染率が一定になるはずなのですが、なぜ、少しでもヘパリンを入れるとガクッと感染率が下がってしまうのでしょうか。先行研究では、感染率が一定になっており、そのプロトコルと同じ方法で実験を行っております。 何か解決策をお持ちの方は、教えてください。

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