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(無題) 削除/引用 No.13157-2 - 2025/11/09 (日) 18:39:26 - TS RIPAで溶かしたものを毎回凍結融解して、サンプルバッファーと処理して使っているんでしょうか。サンプルバッファーまで混ぜて加熱処理したのを繰り返し使うのが一般的ではないかと思います。 この段階までやれば、プロテアーゼは完全に失活しているはずだし、数回凍結融解しても大丈夫な場合が多いと思いますが、リン酸化は少しずつ外れていく印象があります。 GAPDHが大丈夫のように、あとは検出したいターゲットによってケースバイケースとしか言えないでしょう。 わたしは凍結融解の見込みが10回以内くらいであれば、特に小分けはしませんね。特にルールは決めてませんが、それ以上の見込みがあれば、念のため小分けするかもです。 体感で分解している感触があれば、小分けするのが良いと思います。

Western blotサンプルの凍結融解 削除/引用 No.13157-1 - 2025/11/09 (日) 13:43:22 - kae いつも参考にさせてもらっています。 基礎的な質問で恐縮ですが… 数か月前からWestern blotをやりはじめているのですが、蛋白質サンプルは凍結融解を繰り返しても大丈夫と教わり、そのようにしています。 ただ、Collagenを検出しているのですが、一回目の時よりも、二回目の時の方がバンドが薄い気がしてなりません。露光時間はAuto設定でやっていますが、露光時間も30sec→50~60secに伸びています。 GAPDHのバンドは特に変化を感じません（短冊切りにして、別メンブレンとして撮影しています）。 RIPAバッファーでプロテアーゼ阻害剤入りのものを使っています。サンプルは、マウス骨髄ライセートです。蛋白質が分解されてしまっているのか、その他の手技的要因なのか分からず悶々としております。 そこで手間でもサンプルを小分けにして保存した方がいいのか悩んでいるのですが、皆様はサンプルはどのように保管・使用しているでしょうか。よろしくお願い致します。

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