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イソプロパノール沈殿、エタノール洗浄の際にRNAが層になる。 トピック削除
No.13154-TOPIC - 2025/11/08 (土) 16:52:30 - B
質問失礼いたします。
RNA抽出の際、クロロホルム処理の後に、イソプロパノール沈殿、エタノール洗浄をすると、RNA？が層になってしまいます。本来ならその後に遠心をするとペレット状になるはずなのですが、私の場合、半透明のふよふよした下層の上に透明な上層という2層に別れてしまいます。これは、脂肪やタンパク質、塩などが原因なのでしょうか？
また、下の層を回収してRNAの濃度および純度を測っても濃度1.4μg/μl、純度1.3程でした。
　
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No.13154-7 - 2025/11/09 (日) 18:40:11 - B
あのさん、G25さん
返信ありがとうございます。
なるほど、多糖類の可能性があるのですね。
確かに、このサンプルをSDS-PAGEに供した際もサンプルバッファーに入れた際にゲル化が起こってしまい、多糖類を多く含むサンプルではないかという話も浮上していました。
今一度、この下層に対して、LiClや再度TRIzol抽出を行ってみようと思います。

(無題) 削除/引用
No.13154-6 - 2025/11/09 (日) 12:23:37 - G25
> 多糖類の多い材料の時にのIPA沈澱の改変法がTrizolのマニュアルに書いてあったはず。
>水層にクエン酸が主成分のRNA precipitation bufferを加えIPAの量を減らすというような。

Thermo Fisherに行っちゃってからは英語版マニュアルからは無くなってしまったのかな。
日本語版には残ってる。トラブルシューティングのところ
https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/trizol_J_12_Jun_2007_1.pdf

(無題) 削除/引用
No.13154-5 - 2025/11/09 (日) 09:45:53 - G25
透明な上層というのはおそらく多糖類です。グリコーゲンを多く含む材料などでよく経験します。
魚皮だとムチンか何かでしょうか。
多糖はフェノールクロロフォルム抽出では除去されません。

多糖類の多い材料の時にのIPA沈澱の改変法がTrizolのマニュアルに書いてあったはず。
水層にクエン酸が主成分のRNA precipitation bufferを加えIPAの量を減らすというような。

あるいは、そのような沈殿を2 M LiClに再懸濁(ピペッティングやホモジナイズ)した後、遠心してRNAを沈澱して回収(多糖類は上清に残る)という方法もやったことがあります。

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No.13154-4 - 2025/11/09 (日) 07:59:29 - あの
その材料を使ったことはありませんが、哺乳動物の鼻の粘膜組織で似たような経験があります。

当方の意味は、得られたRNA溶液に、もう一度、Trizolを入れて、もう一周するという意味です。

当方の経験では、一周目のサンプルではcDNA合成を失敗していたのが、二周目のサンプルではうまくいきました。

(無題) 削除/引用
No.13154-3 - 2025/11/09 (日) 01:06:28 - B
あのさん
返信ありがとうございます。
元々のサンプルは鱗を含まない魚の外皮となっております。
一応、クロロホルム処理の際は中層のインターフェイスに触れないようには心がけております。
サンプルが少ないため、今のところ2回しか抽出は行っていませんが、2回ともこのようになっております。

(無題) 削除/引用
No.13154-2 - 2025/11/08 (土) 23:15:50 - あの
もともとの材料は何ですか？


クロロホルム層を採取するときには、無理して全部を採取しないで、上半分だけ取るのがコツですが、それでも、同じですか？

変なものが入っていると、cDNA合成等で悪影響する可能性があります。


もう一つの考えられる対策は、そのRNAサンプルを、もう一度、RNA抽出キットで処理することです。

イソプロパノール沈殿、エタノール洗浄の際にRNAが層になる。 削除/引用
No.13154-1 - 2025/11/08 (土) 16:52:30 - B
質問失礼いたします。
RNA抽出の際、クロロホルム処理の後に、イソプロパノール沈殿、エタノール洗浄をすると、RNA？が層になってしまいます。本来ならその後に遠心をするとペレット状になるはずなのですが、私の場合、半透明のふよふよした下層の上に透明な上層という2層に別れてしまいます。これは、脂肪やタンパク質、塩などが原因なのでしょうか？
また、下の層を回収してRNAの濃度および純度を測っても濃度1.4μg/μl、純度1.3程でした。
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