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(無題) 削除/引用 No.13151-3 - 2025/11/07 (金) 05:52:18 - おお >インサートする配列が200bpと長すぎると外注での塩基配列の作成の値段が上がるのも懸念点です。 読み返しましたがインサートはPCRで用意するのでなくて、DNA合成で作るということでしょうか？ それなら２種類のやり方があります、オリゴを作るときにアニーリングするとBsa（など）で切った切断面と相補の５’突出末端ができるようにする。ただし、この場合合成オリゴはリン酸化されてません。インサートにしようとする配列が一種類（タンデムに複数繋げない）なら、ベクター側のBsa（など）の切断面のリン酸化で環状にできますのでライゲーションが成り立ちますが、タンデムにオリゴをつなげたいならオリゴの方にもリン酸がついている必要があります。理解が追いつかないならリン酸かしておいたほうが無難なのでオリゴを注文するときにリン酸化修飾されたものを注文するといいかと。 もう一つの方法はBsa認識部位を末端につける場合で、この場合はBsaで切断すればリン酸がついているのでリン酸化で心配する必要はありません。しかしながらBsa認識部位の外にいくらかの塩基を追加したほうがいいです。NEBのToolではPCRの場合のデザインで６塩基余分につけていて、そのPCR産物をBsaで切る用になってたかと思います。絶対に６塩基ということではないですので７塩基とか長い分には配列がアニーリングで変にならないものならベターかもしれません。 要するに （６塩基）ーBsa認識配列ーNNNNNーYour sequenceーNNNNNーBsa認識配列ー（６塩基） でオリゴを作りアニーリングしてBsaで切りLigationする。 こういうデザインでも２００bpにはならないので、どういう発想だったのか気になるところです。ただ１００bpまでは行かないにしてもいくらかは長くなります。

(無題) 削除/引用 No.13151-2 - 2025/11/05 (水) 21:18:24 - おお >[Re:1] shotaさんは書きました : > となるベクターを使用して、発現する蛋白の途中の17アミノ酸（51bpの塩基配列）を50種類の配列に差し替えて、50種類のタンパクを発現させたいです。 > ベクターの作成法においては、ゴールデンゲート（Golden Gate / GG）法を考えているですが、以下の二つについて教えてください。 > > １，インサートする配列は、51bp+前後のBsaI/BsmBI の認識配列だけでいいのか。それとも効率を考えて、インサートする配列は200bp以上の長さにすべきか（この場合、変化させない130bp前後は、配列はそのままにします。）教えてください。インサートする配列が200bpと長すぎると外注での塩基配列の作成の値段が上がるのも懸念点です。 インサートの長さを長くしたほうが効率がいいと言う理屈が分かりません。一般的には短いほうが入りやすいです。NEB のデザインツールを見ると酵素の認識配列の外側に６ベース延長している様です。自身で確認してみてください。 > > ２，セレクション法はlacZやccdBをもとのベクターの差し替える前の配列に入れると良いみたいですが、lacZとccdBはどちらがおすすめですか。 個人的には必要性を感じません。大腸菌株の選択肢も狭まりますし。ccdB は特に誘導させてない状態のリークでも大腸菌に悪さしてそうでどうかなあと思うことがあります。そもそもターゲットのタンパクの途中をいれかえるのですよね？LacZとか途中に入れちゃうってことですか？ 発現系も何を使ってるのか分からないし、大腸菌で発現させるの？ デザインをもう少し詳しく書いてもらえれば具体的な事を指摘できますが、ちょっと良く分からないことが多いい。

gold gate法でインサートする配列の長さとセレクション法 削除/引用 No.13151-1 - 2025/11/05 (水) 13:57:21 - shota となるベクターを使用して、発現する蛋白の途中の17アミノ酸（51bpの塩基配列）を50種類の配列に差し替えて、50種類のタンパクを発現させたいです。 ベクターの作成法においては、ゴールデンゲート（Golden Gate / GG）法を考えているですが、以下の二つについて教えてください。 １，インサートする配列は、51bp+前後のBsaI/BsmBI の認識配列だけでいいのか。それとも効率を考えて、インサートする配列は200bp以上の長さにすべきか（この場合、変化させない130bp前後は、配列はそのままにします。）教えてください。インサートする配列が200bpと長すぎると外注での塩基配列の作成の値段が上がるのも懸念点です。 ２，セレクション法はlacZやccdBをもとのベクターの差し替える前の配列に入れると良いみたいですが、lacZとccdBはどちらがおすすめですか。

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