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(無題) 削除/引用 No.13120-7 - 2025/09/25 (木) 10:32:38 - T-2 >これをBL21に形質転換し、OD600=0.5あたりでIPTG 1 mMで37度6時間ほど誘導しました。 BL21(DE3ですか?)に入れた後、シングルクローン化してますか？ トータルライセートはSDSサンプルバッファーで直接溶菌させているのか、 抽出試薬でライセートを作っているのか。 Bugbusterで抽出しても上清にはなく、ごくわずかな沈殿物にモノが行ってたこともあります。 あとはベクター全長をシークエンスするか。

(無題) 削除/引用 No.13120-6 - 2025/09/24 (水) 23:14:22 - おお >[Re:5] montさんは書きました : > もし年代物のアンピシリン粉末を使っているなら、新しく買い替えてみてはどうでしょう。 たしかにAmpの安定性は気になるのだけど、同時に他のリコンビナントを発現させて蛋白が精製できてるからねぇ。同程度発現するようなものであればAmpの問題かは疑問ですが、発現しにくいものならAmp活性の低下がいくらか影響するかもしれませんので、考慮してもいいかもしれません。劇的な改善になるかというと自身が持てませんね。

(無題) 削除/引用 No.13120-5 - 2025/09/24 (水) 07:36:25 - mont アンピシリンがヘタってて、培養中にプラスミドが脱落しちゃったとか？ もともとアンピシリンは分解が早く、粉末の状態で4℃保存、頻繁に開け閉めしてると湿気で活性が落ちます。もし年代物のアンピシリン粉末を使っているなら、新しく買い替えてみてはどうでしょう。 溶液4℃保存だと、長くて1ヶ月、1~2週間でも活性は下がるそうです。 −20℃のストックも数ヶ月で活性が落ちるので、アンピシリンの鮮度には注意が必要です。

(無題) 削除/引用 No.13120-4 - 2025/09/24 (水) 01:00:12 - おお 大腸菌でリコンビナントを発現する系では蛋白によって大きく発現量が異なります。物によってはCBBで発現が確認しにくいぐらい低いものもあります。もしWBできるならそれで発現を確認してみてください。あるいはカラムにのっけて精製してみると濃縮されてCBBで検出可能な量取れるかもしれません。個人的には数十ナノグラムで反応させる事が多かったので、CBBで発現の確認が難しい場合でも精製して１マイクログラムも取れれば十分実験ができましたので、その程度の量でいいなら精製してしまっていいかもしれません（発現しているという確証がほしいのでWBはやったほうがいいでしょうけど）。 バックボーンがおかしくなったというのはよほどの限りないと思います。もし自身で作成したプラスミドなら複数のクローンを取っているでしょうし、他のクローンで配列があっているやつを使ってみるのは手です。私の場合は万が一ということもあるので３、４クローンで同時に複数スモールスケールでやるようにしてます。変に逸脱したやつは怪しいからです。 発現を上げる工夫は色々とあります。培養条件、コンストラクト（タグがN末かC末かとかリンカーとか）、大腸菌の株、コドンの最適化などきりがありませんが、こうすれば良くなるという確実なやり方は存在しません。多少は手探りでやってみてもいいのかもしれませんが、個人的にはこれでかなり改善したという感触はないです。根気よくやればいい条件が見つかるかもしれませんが、どこまで時間をかけるかというのもありますし。 比較的うまくいくと聞いている発現が確保できそうな方法論としてはCell free systemです。興味があれば調べてみてください。

(無題) 削除/引用 No.13120-3 - 2025/09/23 (火) 12:00:58 - GST qq様 ありがとうございます。 GSTが発現するかは調べてはいませんが、同時に行ったTaqの発現精製はうまく行ったのでIPTGは問題はなさそうです。 DH5aでもいけるとのこと、試してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.13120-2 - 2025/09/23 (火) 09:07:14 - qq エンプティベクターでGSTが発現することを確認してもよいのではないでしょうか？ プラスミドが現在も取れているようなので、別にBJ21(DE3?)ではなく、JM109やDH5aに入れてみてはいかがでしょう？ pGEX4T2だから、どちらでもいいんじゃないでしょうか？

pGEX-4T2にクローニングした遺伝子が発現しないです 削除/引用 No.13120-1 - 2025/09/23 (火) 07:37:08 - GST こんにちは。 10年近く前に作製したプラスミドを-30度保存し、それを使ってタンパク質を作ろうとしています。 具体的にはpGEX-4T2にある遺伝子800bpほどをクローニングし、配列を確かめGSTとその遺伝子がインフレームであることを確認してあります。 これをBL21に形質転換し、OD600=0.5あたりでIPTG 1 mMで37度6時間ほど誘導しました。 結果はGSHアガロースで採れてくるものがなく、またinputでもそれらしきものが誘導されているのは見られませんでした。 30度、34度オーバーナイトを試してもダメでした。 ただ10年近く前はワークしていました。 プラスミドもGST-目的遺伝子があること、配列が正しいことを再度昨日サンガーで確認しました。 IPTG濃度が高すぎなのか(inputは大腸菌のトータルライセートなので封入体に入っているわけではないです)、プラスミドが壊れてしまっているのか(プラスミドは最近、再度DH5aに形質転換しミニプレップしたものをサンガーで確認して、BL21に形質転換しています)。 ベクターバックボーンにおかしな範囲があるのでしょうか。 再度プラスミドを作り直すべきなのか、何かアイデアを戴けますと大変助かります。 とても困っています。 サンガーの配列を見た際、確かに遺伝子の5’上流にはGSTの3’側の配列があったので、間違いなくGST-目的の遺伝子のはずです。 どうぞよろしくお願いします。

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