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ELISAでなければダメ？ 削除/引用 No.13112-10 - 2025/10/06 (月) 12:45:52 - かんちゃん この実験系で明らかにしたいことは、AとBが結合するってことでしょうか。 もしそうであれば、WBも行えているようですし、BをbaitにしてAをIPしてWBとかじゃダメですか？ Aがどういったタンパクなのかわかりかねますが、ELISAプレートに結合しにくいとか、脱離しやすいとか、プレートに結合するとA-B結合しにくいとかありませんかね？ 研究、うまく行くと良いですね。

(無題) 削除/引用 No.13112-9 - 2025/09/19 (金) 15:54:52 - 九州 >[Re:8] T-2さんは書きました : > もちろん、タンパク質A,Bはちゃんと発現して分泌されていることは確認されていますよね？ WBにて確認しています。 >[Re:6] 774Rさんは書きました : > たとえば糖鎖修飾のされ方の違いで結合性に影響がある可能性は？ > 発現させる細胞によって違ってくることも。 糖鎖修飾等の翻訳後修飾は、現行で議論がさまざまあるようで、、 少し検討します。

(無題) 削除/引用 No.13112-8 - 2025/09/19 (金) 10:28:55 - T-2 もちろん、タンパク質A,Bはちゃんと発現して分泌されていることは確認されていますよね？

(無題) 削除/引用 No.13112-7 - 2025/09/18 (木) 15:51:01 - おお 要するに同じ実験なのに上手くいかないと言う事ですか？ じゃあ先行の研究をしたラボに一度相談してみてはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.13112-6 - 2025/09/18 (木) 11:26:48 - 774R たとえば糖鎖修飾のされ方の違いで結合性に影響がある可能性は？ 発現させる細胞によって違ってくることも。

(無題) 削除/引用 No.13112-5 - 2025/09/18 (木) 10:46:21 - 九州 >[Re:3] おおさんは書きました : > >[Re:1] 九州さんは書きました : > > あるタンパク質A,B[Bは検出用にヒト抗体のIgGをつけてます]を培養細胞で分泌させて、培養上清を用いて相互作用をELISAで見ようとしています。 > > （培養上清は、無血清） > > IgGをつけているってどう言うじょうたいですかね。抗体が結合する事により結合部位が隠れてたりしませんかね。 一応、Fcを付与できるようなベクターに組み込んで、分泌させてます。 先行研究でも、Fc融合タンパク質で見ている例もあるため、結合に対する影響は少ないと考えています。 > > 具体的には、シグナル強度のネガコンとの差がはっきり見えません。 > > > > 結合することは知られているので、似たような系で結合を見ている先行研究を見ると、Wash bufferとして、0.05% Tween/PBSを用いていました。 > > 現在私は、0.1% Tween/TBSを用いています。 > > > 先行研究は同じタンパクですか？ > > 同じタンパク質です。

(無題) 削除/引用 No.13112-4 - 2025/09/18 (木) 10:44:16 - 九州 >[Re:2] みさんは書きました : > 可能性があるかないかと言われたら皆あると答える > やってみたらええがな > そうですよね、、やってみます

(無題) 削除/引用 No.13112-3 - 2025/09/17 (水) 23:57:49 - おお >[Re:1] 九州さんは書きました : > あるタンパク質A,B[Bは検出用にヒト抗体のIgGをつけてます]を培養細胞で分泌させて、培養上清を用いて相互作用をELISAで見ようとしています。 > （培養上清は、無血清） IgGをつけているってどう言うじょうたいですかね。抗体が結合する事により結合部位が隠れてたりしませんかね。 > > 具体的には、シグナル強度のネガコンとの差がはっきり見えません。 > > 結合することは知られているので、似たような系で結合を見ている先行研究を見ると、Wash bufferとして、0.05% Tween/PBSを用いていました。 > 現在私は、0.1% Tween/TBSを用いています。 > 先行研究は同じタンパクですか？

(無題) 削除/引用 No.13112-2 - 2025/09/17 (水) 20:50:33 - み 可能性があるかないかと言われたら皆あると答える やってみたらええがな

ELISAでの相互作用確認 削除/引用 No.13112-1 - 2025/09/17 (水) 20:27:41 - 九州 あるタンパク質A,B[Bは検出用にヒト抗体のIgGをつけてます]を培養細胞で分泌させて、培養上清を用いて相互作用をELISAで見ようとしています。 （培養上清は、無血清） Aをひく ↓ Blocking(5% Skimmilk 溶媒は、0.1% Tween/TBS) ↓Wash x3 Bを供する ↓Wash x3 ヒト抗体IgGを認識するHRP付きの抗体 ↓Wash x4 基質反応 でアッセイしてますが、上手く見れません。 具体的には、シグナル強度のネガコンとの差がはっきり見えません。 結合することは知られているので、似たような系で結合を見ている先行研究を見ると、Wash bufferとして、0.05% Tween/PBSを用いていました。 現在私は、0.1% Tween/TBSを用いています。 これは、Wash bufferを変えると上手くいく可能性はあるでしょうか？ 相互作用自体は、あまり強い分子ではなさそうです。 一応、他にはタンパク質を濃縮することも考えています。 経験等あれば、ご教授していただけますと幸いです。

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