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(無題) 削除/引用 No.13106-3 - 2025/09/10 (水) 15:50:23 - おお キットを使わないのがストレートフォワードだと思いますが。キットの枠にはまらなそうなのをやりくりするより悩みが少ないと思うし。 Sol 1 で懸濁、Sol2で溶菌、Sol３でゲノムを沈殿させて遠心して上澄にイソプロを加えてDNAを沈殿。RNase処理後PEGで沈殿。クロロフォルム処理とか除タンパクするのがクラッシックなやり方だけど、PK処理、Tx114によるリポポリサッカロイド除去という方法が取れるが、PEG沈後PCR purification kit(DNA精製キット)でのぞみのスケールのキャパがあればそれを使って精製してもいい。

(無題) 削除/引用 No.13106-2 - 2025/09/10 (水) 11:10:32 - mont LB＋抗生物質8mLを50mLチューブで振盪培養一晩（蓋をしないで、火であぶったアルミを軽く被せる） 3200gで10分遠心（ラボで使える50mLチューブのマックスなだけです）、２倍量のminiprep溶液で調整（私が使っているキットだと、溶液3を加えると1.5mLぐらいになるのでエッペンチューブに移してMax遠心）、上清をminiprepカラム２本に分け、洗いの過程を倍に増やし、後は普通に溶出しています。DH5a、ハイコピープラスミドだと、ちょうど40から50マイクログラムぐらいの収量です。 注意点： 溶液１の段階は気持ち長めに5分ぐらい（容量少なめなので、完全なRNA分解を促すため時間で稼ぐ感じです） 溶液２は緩やかに混和（蓋するのが面倒なので、転倒混和はしません） 溶液３後は多少激しめに混和（遠心後に上清がクリアでなければ、再度混和、再度遠心） 私はminiprep用のバキュームを使い（自作かキアゲン）、最後のエタノール洗浄の後に、遠心3分で完全にエタノールを取り除いています。 トランスフェクションなど、特に問題に思ったことはありません。 たくさんサンプルがあると、カラムの本数が増えますが、2倍程度ならそれほど苦にならないかな、といった感じです。 収量も私の実験にはちょうど良いので、いつもこの方法です。 ブランドにもよりますが、だいたい20から30マイクログラム/miniprepカラムの収量が期待できるそうです。お使いのカラムの容量から逆算して、培養量、洗いの過程などを調整してみてはどうでしょう。洗い用の溶液はラボに余りがたくさんあるので、私の環境では足りなくなることはないです。

ウイルス作製のための少量のプラスミド精製キット 削除/引用 No.13106-1 - 2025/09/10 (水) 06:01:02 - 安価なキット お世話になります。 現在、遺伝子KOを5種類作製したいと思っています。 一つの遺伝子につき、3つのsgRNAを試すとして合計15個のプラスミドを用意したいです。 全てレンチウイルスベクターのプラスミドになっていまして、すべての実験でせいぜい各50 ugほどあれば実験が終えられそうです。 これまでキアゲンのmidiprepを使って200-500 ugほど得ていましたが、そこまで必要はありませんし、スモールスケール(けれど20 ugほどでは心許ない)で精製できて、安価な方法がありましたら ご教授いただきたいです。 ウイルス作製のために遺伝子導入するのは293Tで、これまで10 ug程度精製できる、miniprep産物(特にエンドトキシンフリーというわけではありません)で遺伝子導入は問題なくできています。 midiprepはコストも高く、3つから一つを選び出すスクリーニング目的です。 よろしくお願いします。

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