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(無題) 削除/引用 No.13102-16 - 2025/09/12 (金) 19:55:02 - JJI 材料、パラフィンの質、試薬、機器の何か悪いのかわかりませんが今の染色工程のどこかに問題があるのかもしれないので、１回、騙されたと思って凍結切片でやってみてはどうでしょうか。凍結切片はパラフィン切片に劣るという先入観がある人は多いし実際そういう組織もありますが、案外、うまくいくとパラフィンと同等に綺麗です。（脾臓の凍結切片も経験ありますし綺麗でした）いくつかバリエーションはありますが、一番一般的なのは臓器を摘出したら未固定でOCTで包埋し液体窒素で凍結してブロックを作ります。（すぐに次進まなければ１〜２ヶ月くらいの目安で−８０℃保存します。）ブロックをクライオスタットで薄切してガラスに貼って十分に乾燥させてから固定します(例 4%PFA-PBSで10分くらい）。当たり前ですが脱パラは不要です。固定したらPBSで何度か洗ってからはあとは同じでHE染色して脱水透徹に進みます。

メッセージをありがとうございます！ 削除/引用 No.13102-15 - 2025/09/12 (金) 19:05:09 - ※△ 度重なる誤字脱字、文字化け、失礼いたしました。 赤脾髄は他の組織より条件の幅が狭いというか、色々ちょうどよくなる必要がありそうですね。 これまでにスライドグラス2枚、顕微鏡で見ても大丈夫そうなHE染色切片ができました。ただ、温度他、条件の異なる2枚で、同一条件で処理した他のスライドグラスの切片は赤脾髄が割れてしまいました。 montさま 薄切間隔、長いと思います。薄切→筆とスライドグラスを持ち替えて水に浮かべ→次の保湿→次の薄切です。ライカ様の101STEPS TO BETTER HISTOLOGYの中に冷やしたブロックから切り出す際、初めは広がった切片、ブロック温度が上がると圧縮(しわが寄ったような)切片の写真が載っています。私が切り出しているのはそこでいう1〜4番のようなブロックの形そのままに広がって切り出せる切片です。 【パラフィン】 よそで作製された薄切しやすい脾臓ブロックは違う種類のパラフィンで包埋されたものだろうと思いました。 共有機器なので難しいかもしれませんが、軟質に変えることで改善が期待できそうですね。 【ミクロトームの刃】 新品刃をどこまで使おうかと考えていました。脾臓の場合2〜3切片で軽いメス傷のようになっていくような感じです。もしかするとこの軽いメス傷もNGかもしれないですね。新品刃というのは1切片ごとに刃の新しい部分を使うということでしょうか？ブロックから不要なパラフィン部分を切り落としてなるべく刃を傷めないよう、脾臓そのものをたくさん切れるようにしています。 【ブロックの冷却】 今後も硬パラフィンで切り出す場合、もしかすると常温薄切できるよう加湿器もしくは保湿のみの方がいいのかもしれない、と考えています。ブロック温度が上がる際に膨張しながら薄切するのも割れにつながりますかね。 ●薄切後の脾臓切片はどのような見た目ですか？ 漠然と、薄切の際に目視で透明な切片はしわが伸びたり赤脾髄が割れにくかったりうまくいきやすい気がしています。逆に赤脾髄が茶色に見えるものはその後しわが伸びなかったり割れたりしてうまくいっていない気がします。厚さですかね。ミクロトーム刃送りを2μmにしても透明にはならず茶色になるのです。 しばらく席を外します。 でも、封入までの工程についてもかみ砕きながら読みます！視野の広がるお話しをありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.13102-14 - 2025/09/12 (金) 12:08:54 - mont ChatGPTに訊いてみただけなのですが。自分で答えるより的を得ていると思ったので、そのまま以下にコピペします。切る前にブロックを氷冷していた場合、実際の切片の厚さは、設定よりも厚くなりがちです。室温でブロックが膨張するので、「切る間隔」が長くなるほど厚くなります。３マイクロで切るのって結構大変なので、実はかなり厚く切れちゃってるのかもしれません。 以下、ほぼコピペです。文字化けすみません。 赤脾髄はもろく、過脱水・過加熱・過伸展で“ひび割れ”が出やすいです。H&E後に割れるなら、主因は展開,乾燥と脱水,透徹の条件であることが多いです。 薄切：3マイクロ（厚すぎると裂けやすい） 水浴：42-45 °C、10秒以内にすくい上げる（過伸展防止） スライド：帯電/シラン化スライド使用 乾燥：60 °C 20-30分（または37-42 °Cで1-2 h）。長時間の高温乾燥はしない 脱パラ：キシレン 2回×3-4分（古い溶媒は不可） 再水和（ゆっくり戻す） 100% EtOH 2回×2分 → 95% 2分 → 80% 2分 → 70% 2分 → 水 （※100%から一気に水へ行かない） Hematoxylin：標準時間（例 5-7分）→ 軽い分別（1%酸アルコール 2-5秒）→ ブルーイング（Scott水/弱アルカリ水 30-60秒） Eosin：0.5-1% Eosin Y（95% EtOHベース、酢酸0.2-0.5%）30-90秒 脱水（ここが割れ対策の肝） 70% → 80% → 95%（各1分）→ 100% ×2回（各1-2分） 100%で長置きしない（脂質が抜けすぎて脆くなる） 可能なら95%止まりで発色確認→薄ければEosin追い染色 透徹：キシレン 2回×2-3分（長時間は避ける） 封入：気泡を避け、過度の圧をかけない（押し広げて裂けるのを防ぐ） よくある原因と対処 過脱水/過透徹：100% EtOHやキシレンが長すぎる → 上記時間に短縮。必要ならイソプロパノールに置換（抽出力が穏やか）。 過伸展（ウォーターバス）：温度過高・長時間漂わせ → 温度↓・時間短縮。水に微量界面活性剤を入れる場合は入れすぎない。 過乾燥：60 °Cで長時間ベーキング、ホットプレート高温 → 時間短縮/温度低下。 パラフィン硬すぎ：融点56-58 °Cのやや軟質パラフィンに変更。 刃・切削条件：新品刃、クリアランス角3-5°、一定送り。 固定・処理：過固定/置換不足でも脆くなる。NBF 24-48 h目安、脱水・キシレン置換を新鮮試薬で均等時間に。 1回で傾向がわかるミニ行列（3枚でOK） スライド100% EtOH(各)キシレン(各)結果の目安 A（標準）2分×23分×2基準 B（やさしめ）1分×22分×2割れが減れば過脱水/過透徹が原因 C（強め）3分×24分×2ここで悪化すれば過脱水が原因確定

硬パラフィン 削除/引用 No.13102-13 - 2025/09/11 (木) 22:00:02 - ※△ 硬パラフィン：硬くすることで薄さが実現するものと理解しました。 包埋専用パラフィン：硬パラフィンと比べると薄切しやすいもののようですね。

パラフィンブロックの組織をより滑らかにするには 削除/引用 No.13102-12 - 2025/09/10 (水) 20:07:15 - ※△ ミクロトームで薄切する際に加湿冷却無しでは組織がポソポソです。 肝臓、胃、脾臓…どの組織もです。 これが普通のことなのか、ブロック作製に失敗しているのかわかりません。 硬パラフィン→包埋用パラフィン（サクラ　Paraffin Wax II60）というようにパラフィンの種類など何かを変えることで滑らかな仕上がりのブロックを作ることができるのでしょうか？それとも、パラフィン置換装置に超音波や減圧加圧があると作り出せるのでしょうか？ パラフィンはどのように使いわけるのでしょうか？ 柔らかい組織＋硬いパラフィン 硬い組織＋柔らかいパラフィン といった感じでバランスを取るのでしょうか？ よそで作製されたパラフィンブロックは加湿冷却無しで薄切できます。 もしご存じの方がいらっしゃいましたら、よろしくお願いします。 突っ込みどころ満載ですよね（^＾;）

誤解がありました 削除/引用 No.13102-11 - 2025/09/10 (水) 19:51:56 - ※△ 【自動包埋】について 開放構造の自動置換装置を使っています。…こちらも自動包埋と呼ぶのですね。 密閉構造の超音波・減圧・加圧のある自動置換装置…そしてこちらも自動包埋ですね。 どちらを使っても 組織は技師さんが手で埋めているということですね。 ●組織ですが、こちらで使っているものは開放型の自動置換装置はおよそ18時間でパラフィン槽に入ります。 ●私が滑らかさに驚いたのは密閉構造の自動置換装置で作られたパラフィンブロックです。 【包埋センター】 設定温度は65℃と書きましたが、60℃でした。 ema様、ピンセットや組織の温度と動き、私の持っている市販の教科書には載っていない内容でした。ありがとうございます！確かに、白く固まってしまうと溶けたパラフィンとは混ざらずに割れてしまいますね。組織を空気に触れさせないこと、ピンセットを液中で扱うこと、ピンセットの温度に気を配ること、次回より気を付けます。 再包埋の際にも組織内のパラフィン状態を考慮します。 ブロックとして固まればいいというわけではないこと、想像を働かせる作業ですね。きっと全ての作業に繊細な気配りがあることと思います。 【加湿器について】 専用機は出力調整ができ、また吐き出しが強いですね。弱い吐き出しだと今と同じ手間がかかってしまいますね。しばらくは手で水を補給することにします。

(無題) 削除/引用 No.13102-10 - 2025/09/10 (水) 13:10:21 - ema ＞一度自動包埋品の薄切をしたことがあり、滑らかさ 手動で古典的にエタノール、キシレン、パラフィン置換をされているということで骨などの硬組織は通常の自動ではなくやっています。 ただ、脾臓は硬いパラフィンではなく通常の硬さ（サクラ　Paraffin Wax II60）で大体十分だと思うのですが。 重要な点は常温で固化したパラフィンは何時間事前に溶かしていますか？３０分（何で溶かしているかも変動しますが）もすればとりあえず溶けて見えますが、均質でないので、２時間前くらいからで揺らして品質を良くします。 ＞モールド内の整列に手間取り、組織をパラフィンバスから出した後しばらく65℃プレート上に置いています。 絶対にやめてください。上部の常温空気に触れている所はみえないけど固まってきていて組織にクラックが入る原因です。 パラフィン曹からすぐさま溶けたパラフィンが入った包埋皿のなかで位置を直すのはいいですが、空気中に出さないでください。つまむピンセットも液体パラフィンにつけたままが基本で、複数本用意してピンセット先のパラフィンが常温で固まりかけたら温かいピンセットに交換して作業するくらいの気を使っています。 同様に再包埋の時に、これも１０分もすれば周りのパラフィンが取れて再度できそうに思いますが、組織内のパラフィンが完全に溶けてなくて、硬さの違いが発生する可能性があるので、３０分以上しっかり溶かしてから再包埋したほうが良いです。 ＞灌流固定無し解剖 PBS　氷冷　2h 10%　ホルマリン ここのPBS２時間の意味が分かりません。そのままホルマリンだと思うのですが。 加湿器は複数ミクロトームを持っているので、市販の加湿器で角度がとれるタイプで代用していました。問題点は通常の加湿器は出力弱く、温度があがる（専用のは水に氷を入れてました）点です。 毎回、筆で面表面を濡らしてから切っても問題ないと思います。

emaさま 削除/引用 No.13102-9 - 2025/09/09 (火) 09:52:03 - ※△ 56℃処理時間について O/Nはオーバーナイトですね。 失礼いたしました！ スライドを立てた状態でもOKなのですね。

包埋ブロック 削除/引用 No.13102-8 - 2025/09/09 (火) 08:46:30 - ※△ おはようございます。 【包埋について】 一度自動包埋品の薄切をしたことがあり、滑らかさに驚きました。 手動包埋には加圧減圧超音波はありません。 それでも今以上の滑らかさは出せるものでしょうか。 今は薄切の際に冷却や浸水無しではポソポソで組織部分が無くなってしまう状態です。 →モールド内の整列に手間取り、組織をパラフィンバスから出した後しばらく65℃プレート上に置いています。置換されたパラフィンが組織から抜けだしたりしますか？ 【薄切について】 家庭用の加湿器にブロックに向かうよう蛇腹ホースを付けたら薄切用加湿器に近くなりますか？ ------------------------------- 10%ホルマリンより前の前処理を追記します。 灌流固定無し解剖 PBS　氷冷　2h 10%　ホルマリン

こんばんは！ 削除/引用 No.13102-7 - 2025/09/08 (月) 23:36:03 - ※△ 標本作製の先輩方、こんばんは。 詳細条件をありがとうございます。 手詰まり感を感じていた中、こんなにもヒントをいただけたこと、 明日からのモチベーションになります。 組織のパサパサにつきましては、手動包埋のためにまだまだ手技が足りていない可能性があります。包埋済みのブロックは加湿や冷却で乗り切りたいと思います。これから包埋分はトライ＆エラーですかね。考えながら埋めていきます。 ミクロトームは回転式のみのため、そのまま頑張ります！ スライドグラスは親水性の松浪フロンティアホワイトですが、親水性のスライドグラスはホットプレート向きとのことです。私の施設においてはホットプレートが無いのでノンコート、剥離防止、撥水性のスライドグラスが適応のようですね。 剥離防止クレストコートはemaさまのところで実績があるとのこと、期待大です。近日中に試してみます！本日・明日はノンコートを使います。 以下2通りはそれぞれ試してみたいと思います。 �@JJI様の条件：ホットプレート長めで貼り付け(他の設備代用) →スライドグラスを若干傾け、インキュベーターかそれに近い設備を43℃に設定し4hから一晩 �Aema様の条件：パラフィン融点付近まで加熱し貼り付け →スライドグラスを若干傾け、40℃台の設備に1h、現行50℃より少し温度を上げパラフィン融点に近い56℃で30minから1hくらい JJI様が大事なことを書いてくださいました。脱パラのキシレン前にはスライドグラスが室温であるように気を付けます。 透徹の30回揺すりは、私の剥がれた切片には優しくないですね。EtOH部分は揺すり2,3回や1秒といったプロトコールを見かけたことがありますので、もっとあっさりしても良いのかもしれませんね。 実は明日胃と肝臓も標本作製します。先輩方もこのあたりの組織は同じプロトコールとのこと、安心して挑戦できます！

(無題) 削除/引用 No.13102-6 - 2025/09/08 (月) 22:00:48 - JJI 固定後はPBSで２回くらい軽く洗ってから自動包埋装置に投入してます。 ブロックにしてからあまり時間（数ヶ月以上とか）が経っていると（特に室温保存だと）パサパサになることあります。4℃保存だと長期保存でもある程度は改善します。薄切で苦労されているならばミクロトームは回転型よりも滑走型の方が良いような気がします。 薄切り前に少しブロックの薄切面を冷やしておくとうまく切れるように感じています。 切片は常温の水道水に浮かせて、スライドガラスで掬い上げるようにして載せてます。 切片はホットプレートで加温することでパラフィンを溶かして貼り付けてます。この過程で水は蒸発し、パラフィンも溶けて、組織はスライドグラス上で伸展します。ここは十分な時間をかけた方がいいです。その後は室温で冷ましてからキシレンによる脱パラフィンの工程に進みます。 胃はやったことないですが、肝臓、心臓、腎臓は脾臓と同じ方法です。問題なく綺麗な標本ができます。脳とか肺は別のやり方があるようです。

(無題) 削除/引用 No.13102-5 - 2025/09/08 (月) 15:28:04 - ema だいたい、※△さんのやりかたと似たような工程で行っています。 ＞70% エタノール 24hrs 私たちも自動包埋装置前で止めるならここ、で冷蔵庫でそのまま保管してます。 加湿器利用 常温水でホットプレートをしていますが ホットプレートなし、なので湯のばしがいると思います。 みんなでホットプレートを使っているので、1時間くらいホットプレートで水を飛ばしたら空けてあげて、下記の56℃　O/N　これはよくあるスライドフォルダーに建てた状態でOK、としています。 ＞50℃加温1h 私たちは　切片の組織とスライドの間のパラフィンを加温によって溶かしてしっ貼りつけるというので「脱パラの一種」作業として　56℃　O/Nで行ってから、保存しています。ここで止められるので未染スライドボックスに入れて大量に保管しています。 ＞氷冷しながら3μmに薄切 組織によっては冷やしますが脾臓は常温で切っています。 ＞親水性スライドガラス 実際には何を使っていますか？私たちはほかの組織がメインなので一緒にしてクレストコートスライドグラスを使っています。 ＞30回揺する そんなにはゆすっていません。薄い切片が置換されればいいので。 ＞パラフィン除去のキシレン キシレンのこともあれば、G-NOX（代替キシレン）のこともあります。 肺、眼球、骨、関節、脳、脂肪組織で条件を変えることはありますが、ご呈示の組織ならあまり変更はないかと思います。

ご返信をありがとうございます。 削除/引用 No.13102-4 - 2025/09/08 (月) 01:49:15 - ※△ 脾臓の標本がうまくいっている方からのご返信大変参考になります。 ありがとうございます。 ホットプレートにつきましては、今のところこちらの施設には設備が無く、また質問者が初心者であるため、必要性について確信が持てずにいました。この操作で貼り付けることができるのですね。赤脾髄がスライドグラスに弱く貼り付けされていたために染色過程において剥がれてしまったとすると有効な改善になりそうです。 大変厚かましいお願いなのですが、差支えないようでしたら他にも条件について確認させていただけますか？ □組織固定後どのように包埋まで進みますか？ □薄切 　→薄切の際にそのまま切り出すと組織がパサパサしています。組織ブロックには加湿器・息かけ・冷却のいずれかを実施していますか？ □常温水に切片を浮かべる 　→湯伸ばしは実施していますか？ □スライドグラスで切片を掬って43℃ホットプレート4h〜一晩 　→スライドグラスは親水性でしょうか？ □このあと、HE染色に向けたパラフィン除去のキシレンでしょうか？ □肝臓や胃などと条件を変える過程はありますか？ 質問者の投稿において不足している情報を追記します。 ●70%EtOH4℃24h、後続の処理で水分を除去するためでもあり、ホルマリン固定後に保管する条件だと理解していました。実際にはこのまま年単位で保管できると聞いています。 ●パラフィン置換、常温の自動置換装置で80%EtOH〜代替キシレン〜パラフィンを12槽で処理します。 ●50℃加温につきましては、切片とスライドガラスの貼り付けを目的としているように思います。 他の施設の文献ではパラフィン融点の60℃で確実な貼り付けを目的に実施されているように読み取れました。 ●【HE染色〜封入】までの条件詳細を省いていました。 実際にはこのように処理しています。 Pre-Xylene 1min 100%Xylene�@ 1min 100%Xylene�A 1min 100%Xylene�B 1min 100%EtOH 1min 100%EtOH 1min 90%EtOH 1min 80%EtOH 1min 70%EtOH 1min 50%EtOH 1min Hematoxylin 5min MillyQ 50℃　2min 水道水洗　15min Eosin 2min 水洗3回 70% EtOH　30回揺する 80% EtOH　30回揺する 90% EtOH　30回揺する 100% EtOH�@　30回揺する 100% EtOH�A 100% Xylene�@　30回揺する 100% Xylene�A　30回揺する マリノール＋キシレン封入 以上です。 ここでお話を伺える範囲でどんなに些細なことでも構いません。お手すきの際に教えていただけるとうれしいです。

追記します。 削除/引用 No.13102-3 - 2025/09/07 (日) 15:47:12 - JJI 追加します。 初めの70% エタノール 24hrs　　4℃はしてません。これは何のためにしているのでしょうか。 同様に50℃加温1hもしてません。 あと染色後に、エタノールなどで脱水処理、続いてキシレンなどで透徹処理をしてから封入して永久標本　という手順と思うのですが、それをしないのはなぜですか。これしないで封入すると時間が経つとともに切片がだんだん（残存している水のせいで）白濁してきてボロボロになると思います。なんか一般的なHE染色とはところどころやり方が違う感じなのですが。 脾臓はたまにパラフィン、凍結どちらの標本も作成してますが特に何か問題起きたというこことないです。

(無題) 削除/引用 No.13102-2 - 2025/09/07 (日) 15:31:32 - JJI 水に浮かせた切片をスライドグラスで掬い上げるようにしてスライドグラス上に乗せて、そのまま43度くらいに設定したhot plateにおいて4~6時間あるいは一晩くらいおきます。この操作は切片を確実にスライドガラスに貼り付けるとともに切片を十分に伸展させるためにとても大切です。書かれている実験手順にこの操作がないのが気になりました。切片が確実かつ均一に貼り付いていないと、染色の過程で接着の弱い部分が引っ張られて切れたり割れたりするような気がします。

マウス脾臓の切片作成およびHE染色 削除/引用 No.13102-1 - 2025/09/06 (土) 16:03:57 - ※△ マウス脾臓の切片作成およびHE染色について質問です。 マウス脾臓でFFPE切片を作成し、HE染色しています。 HE染色前の検鏡では伸展の問題は無く状態が良いように見えますが、HE染色をすると赤脾髄部分の組織が割れます。白脾髄は問題ありません。NOGマウスではさらに割れが広範囲です。 HE染色後の赤脾髄の割れを無くすためにはどのように条件を変えればよいでしょうか？ 固定から染色までの条件は以下の通りです。各試薬は交換したばかりと想定します。同条件でマウス肝臓は問題ありません。 10％ホルマリン24h4℃ 70％エタノール24h〜、4℃ 硬パラフィン(使用パラフィン58-60)置換 包埋後氷冷 (薄切時加湿装置なし) 氷冷しながら3μmに薄切 44℃湯伸ばし 親水性スライドガラス (ホットプレート無し) 37℃インキュベータ24h 50℃加温1h HE染色：染色〜封入の乾燥は無いものとします 他の条件も追記できます。 アイデアやお知恵がありましたら、試していきたいと思います。どうぞよろしくお願いいたします。

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