BioTechnicalフォーラム [初代血管内皮細胞の培養法と線維芽細胞の除去]

初代血管内皮細胞の培養法と線維芽細胞の除去

No.1308-TOPIC - 2013/01/06 (日) 12:51:51 - 心配な新米

初めて質問させていただきます。
現在、マウス肺組織から血管内皮細胞の培養を試みていますが、培養中の線維芽細胞のコンタミと増殖による、血管内皮細胞の純度低下に悩んでます。
内皮細胞の培養方法は、BL6マウス(1-2週齢)を環流脱血-酵素処理-CD31のMACSによる細胞の単離(2つのカラムに通して純度を上げております)で、使用している培地はM199培地にECGSやヘパリンなどを添加し、コラーゲンコートディッシュに蒔いてます。
血管内皮細胞の純度は、CD31で染色して陽性細胞数を評価し、細胞の機能性試験としてTube formationを検討しております。今のところ、MACSの陽性分画のみでTube formationができるので、単離はなんとか大丈夫かと思っておりますが、2～3回の継代ですでに多量の線維芽細胞らしき細胞形態を示す細胞が出現してしまいます(この時点で少なくとも2種類の形態の違う細胞が混在してます)。
培養開始段階での線維芽細胞の完全除去は不可能だと考えておりますが、培養中に少しでも線維芽細胞の増殖を阻害するか、除去できる方法など、ご存知でしたらご教授いただけますと大変有り難いです。
これまでに接着速度の違い(線維芽細胞は早く接着する？)を利用した方法を試しましたが、5分、10分、30分置いても(コラーゲンコート無しのディッシュです)効果は見られていません(コンタミがひどいです)。上皮細胞と線維芽細胞の培養系では、希釈したトリプシン0.05％による分離法やEDTAのみの処理でできる報告は見ましたが、内皮細胞と線維芽細胞におけるそのような違いをよく知らないため、どうしたものかと悩んでおります。
長文になってしまいましたが、どなたかご存知の方、ご経験のある方いらっしゃいますでしょうか。よろしくお願いいたします。
　

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ありがとうございます

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No.1308-5 - 2013/01/16 (水) 13:53:19 - 心配な新米

匿名様
おっしゃる通りだと思います。Fibroのコンタミが増幅してしまう前に実験を終わらせる方が得策ですね。
現在、アドバイスいただいたCD102のダブルMACSを試しているところです。私の手技でも、ある程度の純度と細胞数が得られるようであれば、これでやらせていただきます。
ECGSなどのサプリメント調整も多少試みたのですが、ECだけでなくFibroも元気になってしまいました(VEGFは別個に添加していないので調整は行ってません)。
いろいろと教えていただきましてありがとうございます。諦めずにがんばってみます！

(無題)

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No.1308-4 - 2013/01/15 (火) 01:01:01 - 匿名

fibro除去キットは試したことはありません。やってみても良いかと思います。

ただ印象として、fibroがごく少数でも存在していればいずれ目立ってくるので、現実的にはその前に実験を終えてしまうことになるのではないでしょうか。

あとはECGSを高濃度（100ug/ml）で使うとか、mVEGF165を10-20ng/mlくらい添加するとECの増殖を助けることができます。

ご教授ありがとうございます

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No.1308-3 - 2013/01/14 (月) 01:41:22 - 心配な新米

匿名様
有用なアドバイス、ありがとうございます。
私もこれまでに、初めにすべての細胞を培養してCD102でのMACSもしくはFACSでのソートを試しましたが、少なくとも私の手技内ではCD31によるMACSの方法と純度があまり変わらなかったことと、FACSによる細胞へのダメージが見受けられたため、現在の方法にしています。ですが、CD102での2回のMACSソートは試していないので、是非やってみたいと思います。
また、ECの方が接着が早いというのは、おっしゃる通りだと思います。よく検討してみるとこれまでに行った5分の接着時間の細胞は、数が少ないですがほとんどがCD31陽性でした。トリプシンの方法では、私も上手くいきませんでした。
Fibro特異的な阻害剤も検討してみたいと思います。FibroのディプリーションMACSも試してみたいのですが、ご経験ありますでしょうか。
とても参考になるご助言をいただきまして、ありがとうございました。

(無題)

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No.1308-2 - 2013/01/12 (土) 07:00:58 - 匿名

私はdigestionの後に全ての細胞を撒いてしまいます。confluentになったらMACSでCD102+を集めます。トリプシン処理でCD31はinternalizationを起こすので、この時CD31-abは避けたほうがよいです（それでもある程度はworkしますが）。

confluentになったら再びcd102で集めます。2回くらいやらないとあっという間にfibroに圧倒されます。

それでもp4くらいになるとfibroが目立ってくるので、このくらいがテクニカルには限界だと思います。

Nature ProtocolによるとFACSの方がsortの効率が良いようです。お試しになってもよいかもしれません。

ちなみに接着速度が速いのはECの方です。トリプシンの感受性の違い（ECの方がはがれにくい）で除去する方法も知られていますが私はうまくできませんでした。

D-valine、proline、Blasticidinでfibroの増殖が抑えられるという報告もありますが、私の手ではうまく行きませんでした。

初代血管内皮細胞の培養法と線維芽細胞の除去

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No.1308-1 - 2013/01/06 (日) 12:51:51 - 心配な新米

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