BioTechnicalフォーラム [RIP assayについて。。。]

RIP assayについて。。。

No.1306-TOPIC - 2013/01/05 (土) 16:08:03 - しま

こんにちは。論文の査読で追加実験が必要になったものの、全く素人であるため、ご相談させていただきます。
RNA結合蛋白質に関する研究を行なっており、査読者からある特定のRNAと蛋白質の直接結合を証明するように、とのご指摘がありました。
そこで、いろいろと文献などを調べたところ、MBL社から出ているRiboCluster ProfilerというRIP assayキットが目的に合うのではと思いました。
キットを買ってやってみようかと思うのですが分からないことだらけです。
①myc-tagをつけた遺伝子導入を行い、myc-tagで免疫沈降する予定ですが、myc-tagは目的蛋白質のC末、N末のどちらに付ける方が良いのでしょうか？蛋白同士の免疫沈降の場合に、C末に付けたほうがいいと聞いたことがあったのですが、RIP assayも同様でしょうか。
②得られた蛋白に結合したRNAの解析にはTaqMan primerを用いたreal time PCRを予定しています。primerの設計はどのようなコンセプトで行うものでしょうか？
例えば、primerは、目的RNAのどこでも作って大丈夫でしょうか？それとも、蛋白結合部位をデータベースなどで予測して（？）、ある特定の領域だけ設計するものでしょうか？操作の段階でRNAが断片化してしまうので、短いプライマーの方がいいでしょうか？
質問だらけで申し訳ありませんが、ご教示いただきますよう、どうぞよろしくお願いします。
　

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No.1306-4 - 2013/01/08 (火) 14:11:30 - おお

>[Re:3] しまさんは書きました :
> 詳細なご説明ありがとうございます。
> リコンビナントタンパク質と、合成RNAの結合を見るというので、考えてみます。
> これらを混ぜ合わせて、その後、免疫沈降すればいいということですよね。
> ありがとうございます。

まあ基本そうですが、大過剰の関係ないRNAを加えて(tRNAなど)非特異な吸着を抑えることがおおいです。

ネガコンに何か関係のない配列があった方がよいですけど、配列に検討がつかなければターゲットのRNAを何カ所に分けて、この部分がつかない、こっちがつくというふうにやれば一応説得力はあがりますよね。

クラッシックな検出方法はRIラベルしたRNAをUVでクロスリンクして、RNaseで処理して(分解後もタンパクと接触していたところはUVでコバレンとに結合している)SDSPAGEでながして、タンパクのあるところのRIのアクティビティがあるかをみるほうほうです。この場合結合位置が分からなくてもしぐなるがえられます。

ゲルシフトも結合を見るのに使われますが、RNAの長さが大きすぎるとしんどいです300bぐらいなら何とかなるかなぁ。ゲルシフトなら工夫するとRIなしでも検出できると思います。

タンパクには 6xHisなどがない方がいいといわれています(ないとできないとまではいいませんが)。ヒスチジンの+電荷とRNAバックボーンのリン酸の非特異的な相互作用を避けるためです。

ありがとうございます

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No.1306-3 - 2013/01/06 (日) 10:59:33 - しま

詳細なご説明ありがとうございます。
リコンビナントタンパク質と、合成RNAの結合を見るというので、考えてみます。
これらを混ぜ合わせて、その後、免疫沈降すればいいということですよね。
ありがとうございます。

(無題)

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No.1306-2 - 2013/01/05 (土) 17:33:15 - おお

>[Re:1] しまさんは書きました :
> こんにちは。論文の査読で追加実験が必要になったものの、全く素人であるため、ご相談させていただきます。
> RNA結合蛋白質に関する研究を行なっており、査読者からある特定のRNAと蛋白質の直接結合を証明するように、とのご指摘がありました。

> ①myc-tagをつけた遺伝子導入を行い、myc-tagで免疫沈降する予定ですが、myc-tagは目的蛋白質のC末、N末のどちらに付ける方が良いのでしょうか？蛋白同士の免疫沈降の場合に、C末に付けたほうがいいと聞いたことがあったのですが、RIP assayも同様でしょうか。
> ②得られた蛋白に結合したRNAの解析にはTaqMan primerを用いたreal time PCRを予定しています。primerの設計はどのようなコンセプトで行うものでしょうか？

まずネいティブの状態でIPしても直接の結合は見られませんけど、、、
ほんとにそれでレビューアーへの回答になるのでしょうか?

直接ならクロマチンIPのように、クロスリンクさせておいて(RNAはUVなどよく使われます)一度変性してから、のほうがいいのではないでしょうかね。あまりキットとか考えずともしょせんIPです。

変性にはSDSを使うことが多いです。その後IPに影響がないくらい十分に薄めてからIPをするのですが、SDSの終濃度が0.1ぐらいにするのがたいていで、バッファー組成はRIPAバッファーとしてよく使われる組成になります。その状態でmyc-tagに対して使う抗体がいいかどうかちょっと調べた方がいいかもしれません。

> 例えば、primerは、目的RNAのどこでも作って大丈夫でしょうか？それとも、蛋白結合部位をデータベースなどで予測して（？）、ある特定の領域だけ設計するものでしょうか？操作の段階でRNAが断片化してしまうので、短いプライマーの方がいいでしょうか？

もちろん結合部位が分かるならそれをまたいでいるような短いプライマーにするのがベストでしょうけど、データーベースとかで分かるんですか?

なんだか、リコンビナントと合成RNAで結合見た方が速いような気がしてきました。。。

> 質問だらけで申し訳ありませんが、ご教示いただきますよう、どうぞよろしくお願いします。

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No.1306-1 - 2013/01/05 (土) 16:08:03 - しま

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