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(無題) 削除/引用 No.13011-15 - 2025/07/02 (水) 07:11:35 - 名前 Infusionクローニングに変更することをおすすめ

(無題) 削除/引用 No.13011-14 - 2025/06/28 (土) 09:04:58 - ブラントエンド >下記の文献ではインタクトなプラスミドのUV照射(40mJ/cm2=400J/m2)で顕著なTF効率の低下が見られてます TF効率って、TransFormation効率、形質転換効率の意味で仰ってる、で合ってますか？ その論文にはtransformationという単語は見当たりませんが、私はなにかとんでもない勘違いしてますか？

(無題) 削除/引用 No.13011-13 - 2025/06/28 (土) 03:26:57 - おお UVについて、エチブロなどでのDNA検出に使うtransilluminatorはだいたい20J/m2/sぐらいだそうです。 下記の文献ではインタクトなプラスミドのUV照射(40mJ/cm2=400J/m2)で顕著なTF効率の低下が見られてます。だいたいtransilluminatorで２０秒とかの時間に値します。UV照射ではいろいろなことが起こると思いますが、ピリミジンダイマーはレプリケーションを阻害すると言われていますので、これが一つの原因かと思われ、ピリミジンダイマーは３００nm付近の波長でも起こるので大抵は３６０nmとかを進めているようです（多分検出感度はかなり落ちると思う）。 またどの程度かはわかりませんがUV照射は酸化も促しますので、RecAを持たないクローニング用の大腸菌では修復機構が完全でないためこれも効率に影響すると思われます。 Ghosh S, Wu X, Chen Y, Hu J. Application of UV LEDs to inactivate antibiotic resistant bacteria: Kinetics, efficiencies, and reactivations. Sci Total Environ. 2024 Jul 15;934:173075. doi: 10.1016/j.scitotenv.2024.173075. Epub 2024 May 13. PMID: 38750759.

(無題) 削除/引用 No.13011-12 - 2025/06/21 (土) 14:27:10 - 夏 おお様 「必要ないどころか、Ligationできなくなってしまいます。 末端のリン酸化の状態とLigationへの影響について理解を進めることをおすすめします。」 もう少しきちんと読んでからコメントをしないと明らかにミスリードをしますよ・・。 >[Re:9] おおさんは書きました : > >[Re:6] あのさんは書きました : > > インサート側も制限酵素で切り出したものをと書いてますよ。 > > PCRプロダクトがインサートではないです。 > > あ、リン酸化が必要かと言う質問でしたね。いずれにしろ必要ないですね。

(無題) 削除/引用 No.13011-11 - 2025/06/21 (土) 11:54:30 - mont CIP処理したプラスミドBのみ(インサートなし)では、何個コロニーが出ましたか？ インサートのみ(CIP処理プラスミドBなし)では、何個コロニーが出ましたか？ CIP処理プラスミドB+インサートでは、何個コロニーが出ましたか？

(無題) 削除/引用 No.13011-10 - 2025/06/21 (土) 10:43:37 - おお >[Re:7] ブラントエンドさんは書きました : > えー、その論文、別にUV照射のライゲーションへの効果を調べてる訳じゃないですよね。単にプラスミドにUV照射してからの形質転換効率を測ってるだけで。で、最短のUV照射が10分から始まってる。トピの内容に対してプラクティカルにどうこうを言う場合では参考にならん論文だと思 そういえば Molecular cloning にもUV が良くないと書かれてます。 >

(無題) 削除/引用 No.13011-9 - 2025/06/21 (土) 10:40:39 - おお >[Re:6] あのさんは書きました : > インサート側も制限酵素で切り出したものをと書いてますよ。 > PCRプロダクトがインサートではないです。 あ、リン酸化が必要かと言う質問でしたね。いずれにしろ必要ないですね。

(無題) 削除/引用 No.13011-8 - 2025/06/21 (土) 10:39:00 - おお あ、そうですね。不注意でした。 よく言われるのが、ピリミジンダイマー がTF の効率に影響与えるということです。

(無題) 削除/引用 No.13011-7 - 2025/06/21 (土) 09:34:19 - ブラントエンド えー、その論文、別にUV照射のライゲーションへの効果を調べてる訳じゃないですよね。単にプラスミドにUV照射してからの形質転換効率を測ってるだけで。で、最短のUV照射が10分から始まってる。トピの内容に対してプラクティカルにどうこうを言う場合では参考にならん論文だと思うがなあ。 切り出しの際なんて、みんな気を付けて10秒とかそういうレベルで切り出してますよね？長くても30秒とかからんよね？ 勿論、影響は皆無じゃないんだからUV照射は避けろ、というのはわかりますし、自分もUVあたらないようにしてやってはいるけど。 こういうの、実際に差を調べた人いませんかね？案外、UV当たっても大した差は無いのかも、という気がしてきました。

(無題) 削除/引用 No.13011-6 - 2025/06/21 (土) 08:44:53 - あの インサート側も制限酵素で切り出したものをと書いてますよ。 PCRプロダクトがインサートではないです。

(無題) 削除/引用 No.13011-5 - 2025/06/21 (土) 07:45:06 - おお UVによるダメージはプラスミド、インサートのいろいろなところで起きますからね。 Zhang, C.; Miao, H.; Lei, Z.; Yuan, T.; Zhang, Z.; Ihara, I.; Maseda, H.; Shimizu, K. Decreased Efficiency of Free Naked DNA Transformation by Chlorine and UV Disinfection and Its Detection Limitations. Water 2023, 15, 1232. https://doi.org/10.3390/w15061232

(無題) 削除/引用 No.13011-4 - 2025/06/21 (土) 02:33:34 - ブラントエンド >UVを当てて切り出しをしている場合UV照射は効率を落とす原因となります。 これって平滑末端クローニングでもいえることなんですか？私は突出末端の一本鎖部分ががUVの影響を受けるから効率の下がりが著しいものだと思ってました。平滑末端でももちろん影響はあるでしょうが、突出末端に比べれば全然たいしたことないのかと。 まあ、どちらにしろ私もUV照射は避けますが。

(無題) 削除/引用 No.13011-3 - 2025/06/21 (土) 02:18:17 - おお >当たりのコロニーが得られず困っています。 結構いろいろなところに落とし穴があります。過去の書き込みを参考にしてほしいと思いますが一つかくと、 エチブロなどで検出していてUVを当てて切り出しをしている場合UV照射は効率を落とす原因となります。マーカーと切り出すレーンの端だけUVをあててあとはアルミホイルで覆って当てないようにするとか、青色励起できる色素をつかうか、量が確保できるならギムザやメチレンブルーでゲルを染めるてもあります。 遺伝子AにHpa1サイトがない場合、プラスミドBはCIP処理せずに遺伝子AとLigationして、LigationのあとHpa1でセルフLigationプロダクトを切ってからトランスフォーメーションするとかなりの確率であたりのクローンが取れます。

(無題) 削除/引用 No.13011-2 - 2025/06/21 (土) 02:07:14 - おお 必要ないどころか、Ligationできなくなってしまいます。 末端のリン酸化の状態とLigationへの影響について理解を進めることをおすすめします。

平滑末端クローニング 削除/引用 No.13011-1 - 2025/06/21 (土) 02:01:50 - 瞳 教えてください。 プラスミドAに入った遺伝子AをPme1カットで切り出し、精製しました。 次にプラスミドBをHpa1カットして、CIP処理しました。 遺伝子AをプラスミドBにクローニングしたいです。 その場合、遺伝子Aはリン酸化は必要ないと理解していますが、正しいでしょうか？ 当たりのコロニーが得られず困っています。 ご教授いただけましたら幸いです。

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