全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.13006-18 - 2025/06/23 (月) 07:48:59 - ウォッチャー トピ主さんからのフィードバックを待ちませんか？

(無題) 削除/引用 No.13006-17 - 2025/06/21 (土) 01:57:38 - おお 気になるのは抗原が糖鎖とかペプチド以外だった場合。

(無題) 削除/引用 No.13006-16 - 2025/06/21 (土) 01:52:42 - おお Hadadianpour A, Daniel J, Zhang J, Spiller BW, Makaraviciute A, DeWitt ÅM, Walden HS, Hamilton RG, Peebles RS Jr, Nutman TB, Smith SA. Human IgE mAbs identify major antigens of parasitic worm infection. J Allergy Clin Immunol. 2022 Dec;150(6):1525-1533. doi: 10.1016/j.jaci.2022.05.022. Epub 2022 Jun 24. PMID: 35760390; PMCID: PMC9742163. これは患者のBcellからハイブリドーマをつくってますね。 Reginald, K., Pang, S.L. & Chew, F.T. Blo t 2: Group 2 allergen from the dust mite Blomia tropicalis. Sci Rep 9, 12239 (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-019-48688-y これはいきなりcDNAをクローニングしてますが、そこに至るまでの文献を孫引きしていけばどうやって蛋白を同定したか調べられるのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.13006-15 - 2025/06/21 (土) 01:38:02 - おお Gupta N, Martin BM, Metcalfe DD, Rao PV. Identification of a novel hydroxyproline-rich glycoprotein as the major allergen in Parthenium pollen. J Allergy Clin Immunol. 1996 Nov;98(5 Pt 1):903-12. doi: 10.1016/s0091-6749(96)80006-6. PMID: 8939153. いままでいろいろなアレルゲンが同定されてきてますので文献調査もしてみればどうですか？ >免疫沈降ってそれ用の抗体を作る必要がありますよね…？ 血清のIgE（など）がその蛋白を認識するのだから、すでに特異的抗体を持っているじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.13006-14 - 2025/06/20 (金) 15:33:05 - G25 染色とWBでは検出限界が３桁以上違いますから、後者で見えるけど前者じゃ見えないということは当然ありえます。 だからといって同じタンパク質サンプルを3桁多く乗せるのは無理があるでしょう。 一つの方法は、そのタンパク質が豊富な画分をとって濃縮することです。 大量の出発材料から、核タンパク質なら核を、膜タンパク質なら膜を分画してからタンパク質を抽出するとか、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、　硫安沈殿などで標的タンパク質を含む画分を取得するなど。 いずれにしろ、相当な力仕事になります。

(無題) 削除/引用 No.13006-13 - 2025/06/20 (金) 15:20:23 - G25 あらためてまとめますと、 一次抗体といっているけど、特定のタンパク質に対する確立されたポリクロ、モノクロのようなものではないとのこと。 被験者の血清を抗原パネルにかけてどの抗原に対する抗体を持っているかを調べるアレルギーの検査だとか、病原体の抗原にかけて免疫があるうかどうかを調べる抗体検査のような感じで、供試血清（あるいは総Ig）に含まれる抗体に反応する標的タンパク質を探索するような実験だと理解しました。 その点を踏まえて論議をしましょう。

(無題) 削除/引用 No.13006-12 - 2025/06/20 (金) 14:25:17 - おお >[Re:6] たんぱく研究初心者さんは書きました : > 免疫沈降ってそれ用の抗体を作る必要がありますよね…？ > 目的タンパク質がわからない状態でも可能なのでしょうか？ WBで使っている抗体を使うという事です。

(無題) 削除/引用 No.13006-11 - 2025/06/20 (金) 11:59:32 - rftgyh 細胞や組織の抽出物をwestern　blottingして、抗体と反応するタンパク質のバンドを切り出してMSで分析してタンパク質の分子種を同定するという理解でよろしいでしょうか。電気泳動は通常の１次元のSDS-PAGEですか。それとも２次元電気泳動でしょうか。 １次元の普通の電気泳動ですと目では１本のバンドでもそこには主要なものだけでも数十から時には百を超えるタンパク質が重なっているのが普通ですので、抗体がどのタンパク質と反応しているかを特定するのは困難と思われますし、必ずしもそのバンドに含まれるもののうち主要なタンパク質と反応しているとは限らないですがどうでしょうか。候補に上がってきたタンパク質を一つずつリコンビナントを作成して、どれと反応しているかを検証していくとかになると思いますが結構大変な仕事になるような気がします。 ２次元電気泳動であれば、初めからかなり絞り込める（うまくいけば一義的に同定することもできる）と思いますが、ほぼ全ての蛋白質を分析対象にできる通常の１次元のSDS-PAGEと異なり、２次元電気泳動では、分離できるタンパク質の種類は必ずしも多くはありません。分子量100~150KDaを超えるような高分子量タンパク質や疎水性の強い難溶性タンパク質、HistoneなどのようにpIが極端に高いタンパク質もしくは極端に低いタンパク質を分離するのは困難です。 免疫沈降などimmunoaffinity purificationは有用と思いますが、IPが可能かどうかは抗体によりますのでやってみないとわかりません。また、抗原タンパク質だけでなくそれに結合している他のタンパク質も一緒に回収されてくるので、それらとの識別もリコンビナントタンパク質のwesten blottingなどでチェックが必要になります。

(無題) 削除/引用 No.13006-10 - 2025/06/20 (金) 11:01:06 - たんぱく研究初心者 まさにそうです！！ 野菜とかの植物から抽出したタンパク質に対して行ってます！

(無題) 削除/引用 No.13006-9 - 2025/06/20 (金) 10:52:10 - G25 通常血清中の総イムノグロブリンのようなもの？ 例えば供試個体が何に対する抗体を持っているか探索するような？ 泳動しているサンプルはどんなもの？

(無題) 削除/引用 No.13006-8 - 2025/06/20 (金) 09:09:51 - たんぱく研究初心者 何に対する抗体を持っているか分からない一次抗体を用いて、いろんなものの粗抽出物にたいしてWBを行っています！

(無題) 削除/引用 No.13006-7 - 2025/06/19 (木) 12:45:21 - TS そこが最初からよくわからなかったんですが、WBは他のタンパク質を検出しているということですか。どのような目的なんでしょう。

(無題) 削除/引用 No.13006-6 - 2025/06/19 (木) 11:53:25 - たんぱく研究初心者 免疫沈降ってそれ用の抗体を作る必要がありますよね…？ 目的タンパク質がわからない状態でも可能なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.13006-5 - 2025/06/19 (木) 10:50:10 - たんぱく研究初心者 CBBかSYPRO RubyでPAGE画像を確認しまいました。 まだ銀染色はやったことがないです（自分の選択肢にも出てきてませんでした…） 先程それぞれの感度について調べてみたのですが、ケミルミってこんなに感度が高いんですね！ やり方の候補も教えていただきありがとうございます。 転写してダイレクトブルーで確認できない量だとMSは難しそうだ、とお話をいただいているので、３つ目はできないかもしれません… 免疫沈降もまだやったことがないので調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.13006-4 - 2025/06/19 (木) 01:48:51 - おお PAGEで見えないというのはゲルをCBBや銀染色で検出できないということでしょうか？WBの検出感度とゲルの染色の検出感度を一度確認してください。いまのケミルミはpgオーダーの検出が可能だったりします。CBBや銀染色はだいたいngオーダーじゃないですか？ でその抗体で検出される蛋白をMSに持ち込みたいのですね。考えられるやり方として ・粗精製をして。PAGEにのせる目的の蛋白の量をふやす。 ・免疫沈降をして目的の蛋白を回収する。そのままMSに持ち込むこともあるし、電気泳動してからゲル切り出しをすることもある。 ・WBをして、検出された位置のメンブレンを切り出して、それをMSにまわす。このときブロッキングにはPVP40をつかう（蛋白性のものはさける）。 MSの依頼先にも相談してみてください。メンブレン切り出してもうちではそういうサンプルは経験がないとか言われるかもしれないので。

(無題) 削除/引用 No.13006-3 - 2025/06/18 (水) 19:14:04 - TS WBで見える見えないのくだりの意味がよくわかりませんが、MSでの同定を目指していて、CBBでバンドが見えないとおっしゃっているのであれば、他のコメントになるように、銀染色が常套手段と思います。

(無題) 削除/引用 No.13006-2 - 2025/06/18 (水) 18:26:50 - カンド 銀染色と高感度ウエスタンだと検出感度は1000倍くらい違うと思うけど。

PAGEで見えないのにウェスタンで検出されるタンパク質の謎 削除/引用 No.13006-1 - 2025/06/18 (水) 17:40:12 - たんぱく研究初心者 タンパク質研究を始めたばかりのものです。 SDS-PAGEでは検出されないのにウェスタンでははっきりとバンドが確認できる部分があり困っています。 PAGEの際のタンパク量を増やしても、感度の高い試薬にしても存在が視認できません。 最終的にはMSによるタンパク質同定を行いたいため、現状どうすればいいか… 同じようなご経験のある方がいたらアドバイスお願いいたします。

全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---