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ウイルスストック作製について 削除/引用 No.1300-7 - 2013/01/08 (火) 09:42:57 - ぱるる in situ様 ありがとうございます。 細胞に感染させてＣＰＥで死滅した後に上清回収からの遠心と、いうプロトコルは同じの様ですね。 ご指摘を受けたmoiの考慮を念頭に置いて作製したいと思います。 ご教授ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1300-6 - 2013/01/07 (月) 21:09:48 - in situ 僕はVeroじゃなくてBHKを使っていますが、VSVは種を問わずかなり増えがよいのでVeroでも大丈夫だと思います。 増やし方は75cm2フラスコにmoi=0.001程度でVSVのストックを加えて、24時間くらい待つとほとんど細胞が死ぬので、上清を回収して細胞を遠心して、分注保存するだけの簡単なものです。 お示しのプロトコルと違うのは、途中で6cm dishから15cm dishにパスしないというところでしょうか。 でも、そこはラボによってやり方が違うと思うので詳細をラボの人にちゃんと確認してみてください。

ウイルスストック作製について 削除/引用 No.1300-5 - 2013/01/07 (月) 20:44:15 - ぱるる in situ様 ご指摘ありがとうございます。 確かにいろいろ調べるとmoiを計算したうえでストックは作製するものみたいですね。 次回以降moiを考慮して作ろうと思います。 ご面倒をおかけして申し訳ありませんが、もしお答えできるのならば、in situ様はどのようなプロトコルでストックを作製されているのかご参考にさせては頂けないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1300-4 - 2013/01/07 (月) 11:12:25 - in situ >初めに6cmdishコンフルのVero細胞にVSV溶液を1ml(このVSV溶液はパッセージ回数が少ないほうがいいと言われましたが、大元を把握してないので要確認と思っています。)添加し、全ての細胞がCPEを起こすまでインキュベートします。 この部分ですが、原液を1mlかけているのであればhigh MOI過ぎると思います。 高濃度で感染させすぎると増えにくいので、MOIを計算して0.001〜0.01程度にして感染させるとよいと思います。

ウイルスストック作製について 削除/引用 No.1300-3 - 2013/01/07 (月) 11:07:49 - ぱるる Harmonia様 ご返信ありがとうございます。 >あなたの所属するラボでは、やったことがあって、かつ、どのくらいのタイ ターなら合格ラインか、という情報があるわけですよね？ どのくらいならＯＫでしょうか？ 同じ手法で前回やると、10^10くらいのタイターのものが得られました。 moiを高くする実験では高タイターのウイルスストックを作成しなければならないため、最低でも10^7くらいのものは欲しいです。 >タイターの算出は、誰がやっても同じ値になるのでしょうか？ つまり、実は期待通りのタイターのウイルスなのに、何かの手違いで実際 より低い値が算出されているとか。 計算法は統一しているので同じ値になると思います。 ウイルスストックを系列希釈してVero細胞に播種した際に、明らかに高タイターと低タイターでプラークを形成できる希釈限界に差があるのでそこは大丈夫だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1300-2 - 2013/01/04 (金) 21:50:16 - Harmonia あなたの所属するラボでは、やったことがあって、かつ、どのくらいのタイ ターなら合格ラインか、という情報があるわけですよね？ どのくらいならＯＫでしょうか？ タイターの算出は、誰がやっても同じ値になるのでしょうか？ つまり、実は期待通りのタイターのウイルスなのに、何かの手違いで実際 より低い値が算出されているとか。

ウイルスストック作製について 削除/引用 No.1300-1 - 2013/01/04 (金) 10:57:41 - ぱるる 明けましておめでとうございます。 昨年は皆様の高い知識を大変参考にさせていただきました。 本年もよろしくお願いします。 早速今年も皆様のお力添えをお願い致したくご質問させていただきます。 私は現在VSVというRNAウイルスを用いた実験を行っているのですが、細菌凍結ストックのタイターが上がらず、高タイターなストック溶液を得ることができていません。 ラボで教わったウイルスストック溶液の作製法は、初めに6cmdishコンフルのVero細胞にVSV溶液を1ml(このVSV溶液はパッセージ回数が少ないほうがいいと言われましたが、大元を把握してないので要確認と思っています。)添加し、全ての細胞がCPEを起こすまでインキュベートします。その後、上清を15cmdishコンフルVero細胞に再度添加します。そして元気なVSVなら1,2日で全てCPEにより細胞が死ぬので、この上清をファルコンチューブに回収し、遠心(1100rpm,5min)で細胞を落とし、上清をクライオチューブに1mlずつ回収し、-80℃でFreezeし、タイトレーションによりタイターを計測しています。 しかし、最近では10^5程度のタイターのストックしか作製できていません。やり方にご指摘があったり、何か他の方法などで高タイターのストックを作製している方がいらっしゃったらご教授お願いします。

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