初めて相談させていただきます。
Western blottingで目的のタンパクのバンドが検出されず、困っております。
ポジコンではバンドが確認できており、一応Western自体の操作には大きな問題はないと考えています…。
一方で、カラム精製の過程において、フロースルー画分で目的と思われるバンドが検出されることがあり、カラムへのタンパク吸着が不十分である可能性を考えております。
以下の条件でタンパク発現・抽出を行っています。
■使用したベクター・菌株
・GSTタグ付きのrecombinant DNAを使用
・BL21(DE3) Competent Cell（Thermo Fisher）に形質転換
- コロニーPCRにて目的バンドの検出を確認
■培養条件
・LB培地（+ABPC）にてovernight振盪培養
■タンパク抽出条件
・Pierce™ GST Spin Purification Kit（Thermo, 製品番号：16106）使用
・抽出試薬：B-PER® Bacterial Protein Extraction Reagent（Thermo）
・添加物：リゾチーム、DNase I（いずれも規定量）、プロテアーゼ阻害剤も添加済
■これまでに試した対応と結果
・カラムロード後、overnightでインキュベーション → Westernでバンド出ず
・別のrecombinant DNAを用いて同様に抽出 → バンド出ず
・カラムを使わず、B-PER添加後に超音波破砕して直接Western → タンパク濃度はやや低いが成功
（こちらを使用し、GST抗体のWesternも実施、バンドを確認した）
・上記超音波破砕後にカラム精製 → バンド検出されず
・溶出バッファーにDTT 1mM添加 → 効果なし
・B-PER試薬添加時にもDTT 5mMを追加 → 効果不明（Westernでバンド出ず）
・溶出バッファーの濃度を通常の2倍に変更 → バンド出ず
カラム吸着や溶出の条件に問題があると考えております。
早期解決のためにはカラム自体を変更することも検討すべきかもしれませんが、現在のキットや試薬を使って工夫できる点がございましたら、ぜひご助言いただけますと幸いです。
なお、記載に不備や不明瞭な点がございましたら、ご指摘ください。
どうぞよろしくお願いいたします。 |
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