BioTechnicalフォーラム [GST融合タンパク抽出]

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No.12999-24 - 2025/06/17 (火) 23:14:11 - おお

WBで発現とか一応見ているようだし、ポジコンとか同じベクターGSTだけのものとかなのかと思うとIPTG誘導性でないなにか特別なベクターなのかとも思ってしまうが（言えないという話も含めて）、

ぎゃくにWBで見ているので誘導が必要なベクターでもいくらかリークしていて、それが見えているだけかもしれないとも思える。

(無題)

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No.12999-23 - 2025/06/17 (火) 21:32:41 - qq

＞■使用したベクター・菌株
＞・GSTタグ付きのrecombinant DNAを使用
＞・BL21(DE3) Competent Cell（Thermo Fisher）に形質転換
＞　- コロニーPCRにて目的バンドの検出を確認

これだけを見ると、果たしてGST-fusionの組み換えプラスミドが取れているのかすら疑問ではあります。
まさか、コロＰだけが根拠ではないのですよね？
それともGST-fusion蛋白のプラスミドをもらっての実験だろうか？
でも、スレはここでクローズかな、、

(無題)

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No.12999-22 - 2025/06/17 (火) 18:46:37 - G25

いずれ市販のベクターを骨格にしているのだろうから、なぜ開示できないのかなあ。
口外をはばかれるようなやらかしだからですか？
DE3はIPTGで誘導するのを前提とした宿主ではあるがな（DE3は必要ではないけどあってもじゃまにならないからちうだけかもしれないけど）。

最近の発現系製品のマニュアルは、すべてが理想的にいった場合の王道しか書いていない傾向を感じています。つまりいきなり発現誘導した菌体をライセートにしてカラムにかけるだけ、みたいな。本当なら、昔ながらといか基本を守ってというか、色々なポイントで確認しながらやるべきだと信じています。目隠しでカラム精製までやってWesternで見えませんでしたというのじゃあまりに杜撰な実験ではないか。中間段階でいくらでも問題は起こり得ます。
まず、スタートのlysateをWesternしてまでも「濃度が低い」レベルでしか検出できなかったというのは、タンパク質発現系としては端から失敗でしょう。

・誘導前後のwhole lysateでSDS-PAGE(WesternではなくCBBで全タンパク質染色）して比較し、目的の融合タンパク質が十分に発現しているかどうか確認（場合によっては誘導条件を振って最適化）。通常、CBB染色でもバンドが確認できるくらいの発現があるもので、またそれくらい発現していないと単離取得するのは厳しい。十分な発現がない場合は培養、誘導条件を振ったり、宿主ベクター系を変える。

・誘導したlysateを遠心して上清（可溶画分）と沈殿（不溶画分、封入体）をそれぞれSDS-PAGEして融合タンパク質がどちらにあるかを確認する。

・上清に大部分あるいは十分量の融合タンパク質があったらカラム精製に進む。不要画分にある場合は、可溶画分に行くように培養条件を振るか、変性剤などで可溶化を試みる。

・可溶性のタンパク質でも（変性して可溶化したタンパク質は特に）、アフィニティーカラムでうまく精製・溶出できるとは限らないので、そうなったら別の手を考える（ゲルろ過などで別の方法で精製するとか、タグや宿主ベクター系を変えるとか）。

(無題)

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No.12999-21 - 2025/06/17 (火) 16:44:00 - yy

申し訳ありませんが、開示は厳しいです。
IPTGが必要か判断しないと、根本的なミスになっている可能性はあるので、ラボの同僚にも相談しながら確認しようと思います。ありがとうございます。

>[Re:18] おおさんは書きました :
> お使いのベクターを開示できますか？IPTGが必要なのか判断ができないです。

(無題)

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No.12999-20 - 2025/06/17 (火) 16:41:14 - yy

未熟者に教えて頂きありがとうございます。
方針を決めるためにも確かめてから進めていこうと思います。

>[Re:17] おおさんは書きました :
> これを確かめないとてをどのように打つのか決めるのに困ると思いますよ。

(無題)

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No.12999-19 - 2025/06/17 (火) 16:38:27 - yy

遠心で上清にいっている仮定で進めてしまっていました。
ご指摘ありがとうございます。

>[Re:16] 774Rさんは書きました :
> B-PERで菌を壊した後、遠心で上清にいくか沈殿にいくか試してください。

(無題)

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No.12999-18 - 2025/06/17 (火) 06:40:13 - おお

お使いのベクターを開示できますか？IPTGが必要なのか判断ができないです。

(無題)

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No.12999-17 - 2025/06/17 (火) 06:38:02 - おお

>[Re:11] yyさんは書きました :

>
> 吸着してしまっている可能性もあると思います（否定できておりません）。
> ただ、フロースルーを抜けて吸着そのものも不十分である可能性を上げています。ご意見を頂きありがとうございます。

これを確かめないとてをどのように打つのか決めるのに困ると思いますよ。
フロースルーにあったとしても全く吸着しないと言えません。例えば一部の蛋白はアグってGSTが露出してないが、露出しているものはちゃんとついているとか言うこともあるのでしっかりと確認しながら進めてください。

(無題)

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No.12999-16 - 2025/06/17 (火) 05:20:47 - 774R

B-PERで菌を壊した後、遠心で上清にいくか沈殿にいくか試してください。

もし沈殿にいってる（つまり不溶性）ならGST精製カラムに結合できません。

>[Re:10] yyさんは書きました :
> >[Re:2] 774Rさんは書きました :
> > 発現させたGST融合タンパク質が可溶化してるかどうかの情報はありますか？
>
> SDS-PAGEを実施していますが、それ以上の情報はなく、申し訳ありません。
> 実験手順が着実にできているか評価しながら進めていこうと思います。
> ご意見を頂きありがとうございます。
>
>

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No.12999-15 - 2025/06/17 (火) 03:49:12 - yy

> フロースルー画分の目的のタンパクがあるとしても吸着したタンパク量が溶出できて実験に使えるタンパク量が取れるならそれでもだいたいOKかなと思えます。だから、カラムについているかどうか一度確認するべきでしょう。

フロースルーを評価した際には毎回バンドが出ています。カラム付着の評価も行うべきですね、ご意見を頂きありがとうございます。 Detergentについての情報も助かります。

(無題)

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No.12999-14 - 2025/06/17 (火) 03:45:07 - yy

>[Re:7] おおさんは書きました :。
> PVP40やBSAをカラムにロードしてしばらく静置したあと、平衡化するという手順。

教えて頂きありがとうございます。
こちらは行ったことがないため、参考にさせて頂きます。

(無題)

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No.12999-13 - 2025/06/17 (火) 03:43:44 - yy

>[Re:6] おおさんは書きました :
> 大抵はアガロース（お示しのものも）かセファでックスの支持体でそれなら劇的に変わるだろうかとおもいますが、、、
> もう一つのオプションとしては磁気ビーズかもしれませんが、支持体があるのには変わりません。色々試せるならやる価値がないとは言いませんけど。

ご意見を頂きありがとうございます。
試せるものの数にも限りがあるので、磁気ビーズも含めて吟味していこうと思います。

(無題)

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No.12999-12 - 2025/06/17 (火) 03:41:45 - yy

>[Re:5] おおさんは書きました :

> このようなことを避けるにはたとえばB-PERでカラムを平衡化して、B-PER＋Glutathioneで溶出するというやり方が一つ候補と思われます。あるいはBufferなど文献など参考にして自身でDetergentを入れて作ってみるか。絶対的な解決方法ではありませんし、下流の実験でつかったDetergentがじゃまになるかも考慮すべきところです。
>

丁寧に教えて頂きありがとうございます。
「B-PERでカラムを平衡化して、B-PER＋Glutathioneで溶出」こちらは特に早期に実践できそうな気がしています。

(無題)

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No.12999-11 - 2025/06/17 (火) 03:38:27 - yy

>[Re:4] おおさんは書きました :
> カラムの支持体に吸着してしまって溶出できない可能性は否定できてますか？

吸着してしまっている可能性もあると思います（否定できておりません）。
ただ、フロースルーを抜けて吸着そのものも不十分である可能性を上げています。ご意見を頂きありがとうございます。

(無題)

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No.12999-10 - 2025/06/17 (火) 03:35:14 - yy

>[Re:2] 774Rさんは書きました :
> 発現させたGST融合タンパク質が可溶化してるかどうかの情報はありますか？

SDS-PAGEを実施していますが、それ以上の情報はなく、申し訳ありません。
実験手順が着実にできているか評価しながら進めていこうと思います。
ご意見を頂きありがとうございます。

(無題)

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No.12999-9 - 2025/06/17 (火) 03:31:45 - yy

>[Re:3] nonameさんは書きました :
> すみません、失礼を承知でお聞きしますが、
> IPTGでの誘導はしてますでしょうか。
> それとも誘導がいらない系だったりしますか？

不慣れなため、無知で申し訳ありません。
IPTGの誘導はしておりません…。
（コールドショックなどはBL21の手順通りに実施していました。）
必要な系にも関わらず、行っていなかった可能性が挙がっています。
教えて頂きありがとうございます。

(無題)

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No.12999-8 - 2025/06/17 (火) 02:37:03 - おお

>フロースルー画分で目的と思われるバンドが検出されることがあり、

検出されたり、されなかったりするのですか？フロースルー画分の目的のタンパクがあるとしても吸着したタンパク量が溶出できて実験に使えるタンパク量が取れるならそれでもだいたいOKかなと思えます。だから、カラムについているかどうか一度確認するべきでしょう。

蛋白や発現系によっては菌体内で蛋白がアグっていてうまく吸着しないことがあります。一度変性させてリフォールディングするとか、0.5%以下のサルコシル（そこそこ強いDetergent）でアグリゲーションをほどいてカラムに吸着させてマイルドなデタージェントに置換して溶出するとかしている文献も見かけます。サルコシルでなくて２Mぐらいの尿素を使ったものも確かあったかと。

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No.12999-7 - 2025/06/17 (火) 02:20:30 - おお

もう一つやれることはビーズのコート（ブロッキング）です。
PVP40やBSAをカラムにロードしてしばらく静置したあと、平衡化するという手順が普通かと思われます。これもどれだけ効果があるかはよくわかりません。ノンスペが減らせるとも言われてます。

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No.12999-6 - 2025/06/17 (火) 01:15:55 - おお

>早期解決のためにはカラム自体を変更することも検討すべき

大抵はアガロース（お示しのものも）かセファでックスの支持体でそれなら劇的に変わるだろうかとおもいますが、、、
もう一つのオプションとしては磁気ビーズかもしれませんが、支持体があるのには変わりません。色々試せるならやる価値がないとは言いませんけど。

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No.12999-5 - 2025/06/17 (火) 01:09:43 - おお

This reagent contains a proprietary, mild, nonionic detergent in 50mM sodium phosphate (pH 7.5),
https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0011368_BPER_Bacterial_Protein_Extract_Reag_UG.pdf

Equilibration/Wash Buffer, 250mL, 125mM Tris, 150mM sodium chloride, pH 8.0
https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0011721_Pierce_GST_Spin_Purifi_UG.pdf

まずB-PERにはDetergentが入ってますね。どのDetergentか明らかにしてませんがTX-100とかNP-40とかでしょうか。もう少しマイルドなものかもしれませんが、可溶化する力を考えるとどうかなと。

一方GST Spin Purification KitにはDetergentが入っていません。発現した蛋白の疎水性の部分がDetergentで保護されている場合Detergentを抜くとそこが露出して蛋白同士や近傍にあるもの（カラムの支持体）にアグってしまって外れなくなるとこたあります。

このようなことを避けるにはたとえばB-PERでカラムを平衡化して、B-PER＋Glutathioneで溶出するというやり方が一つ候補と思われます。あるいはBufferなど文献など参考にして自身でDetergentを入れて作ってみるか。絶対的な解決方法ではありませんし、下流の実験でつかったDetergentがじゃまになるかも考慮すべきところです。

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