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(無題) 削除/引用 No.12997-12 - 2025/06/19 (木) 01:32:09 - おお >[Re:9] クロンさんは書きました : > > もし一つのクローンに複数のプラスミドが入ってそのまま両方のプラスミドを維持してコロニーを作った場合、そのコロニーをプレートに線画培養して新たにコロニーを拾っても複数のプラスミドが入っているように思えますが。 > > そうではありません。あなたもお書きになっていたように、プラスミドの不和合性というものがあって、複数のプラスミドを保持した状態は不安定です。ですから、コロニーの中には複数のプラスミドが共存していますが、シングルセルの中には一方のプラスミドしか含まれていない、それをシングルセルアイソレーションで分けとるという話です。 > > ありがとうございました。そういうことなんですね。２つ入ってコロニーができるとしか書いてないので勘違いしてました。たしかにそれはあると思います。通常のコンストラクションを作るとき、Transformation直後に複数のプラスミドが入っているっていうのはそんなに稀ではないと思ってます。プラスミドライブラリーを作るときは大腸菌に一つだけプラスミドが入るようにしないとライブラリーが偏るので、通常のコンストラクションより少なめにすることが多いので。

(無題) 削除/引用 No.12997-11 - 2025/06/17 (火) 12:33:43 - クロン 失礼。「可能性が考えられます」でした。

(無題) 削除/引用 No.12997-10 - 2025/06/17 (火) 12:32:36 - クロン > この辺はどうやったら証明できるんでしょうね。たまたま異なるクローンが同じ場所で増えている場合もあるかもしれませんし。 ですから、最初から「可能性があります」と書きました。

(無題) 削除/引用 No.12997-9 - 2025/06/17 (火) 12:31:25 - クロン > もし一つのクローンに複数のプラスミドが入ってそのまま両方のプラスミドを維持してコロニーを作った場合、そのコロニーをプレートに線画培養して新たにコロニーを拾っても複数のプラスミドが入っているように思えますが。 そうではありません。あなたもお書きになっていたように、プラスミドの不和合性というものがあって、複数のプラスミドを保持した状態は不安定です。ですから、コロニーの中には複数のプラスミドが共存していますが、シングルセルの中には一方のプラスミドしか含まれていない、それをシングルセルアイソレーションで分けとるという話です。

(無題) 削除/引用 No.12997-8 - 2025/06/17 (火) 09:44:05 - おお >[Re:4] クロンさんは書きました : > トランスフォーメーションの際に1匹の大腸菌に複数のプラスミドが取り込まれてコロニーを作った可能性が考えられます。皆さんがお書きになっているように、元のコロニーを新しいプレートに広げ直してシングルコロニーアイソレーションすれば解消しますし、 もし一つのクローンに複数のプラスミドが入ってそのまま両方のプラスミドを維持してコロニーを作った場合、そのコロニーをプレートに線画培養して新たにコロニーを拾っても複数のプラスミドが入っているように思えますが。

(無題) 削除/引用 No.12997-7 - 2025/06/17 (火) 09:37:02 - おお >[Re:6] クロンさんは書きました : > > 通常はそれでもプラスミド同士でCompeteしてするので精製すると電気泳動やなど通常の方法では一つのプラスミドしか検出できないですけどね。 > > 通常でないケースもあるということです。 > > この辺はどうやったら証明できるんでしょうね。たまたま異なるクローンが同じ場所で増えている場合もあるかもしれませんし。

(無題) 削除/引用 No.12997-6 - 2025/06/17 (火) 07:50:16 - クロン > 通常はそれでもプラスミド同士でCompeteしてするので精製すると電気泳動やなど通常の方法では一つのプラスミドしか検出できないですけどね。 通常でないケースもあるということです。

(無題) 削除/引用 No.12997-5 - 2025/06/17 (火) 01:22:32 - おお >[Re:4] クロンさんは書きました : > トランスフォーメーションの際に1匹の大腸菌に複数のプラスミドが取り込まれてコロニーを作った可能性が考えられます 通常はそれでもプラスミド同士でCompeteしてするので精製すると電気泳動やなど通常の方法では一つのプラスミドしか検出できないですけどね。

(無題) 削除/引用 No.12997-4 - 2025/06/16 (月) 16:59:43 - クロン トランスフォーメーションの際に1匹の大腸菌に複数のプラスミドが取り込まれてコロニーを作った可能性が考えられます。皆さんがお書きになっているように、元のコロニーを新しいプレートに広げ直してシングルコロニーアイソレーションすれば解消しますし、ご自身でお書きになっているようにミニプレップを再度形質転換することによっても解決できます。

(無題) 削除/引用 No.12997-3 - 2025/06/14 (土) 17:12:23 - おお 複数のクローンを拾って全部そうだったという事ですか？ そのクローンを保存しているなら、線画培養してもう一度コロニーを拾ってみるのは既に指摘が有り、常套手段だけど、上記の質問の回答など状況次第で対処方法が違ってきそう。

(無題) 削除/引用 No.12997-2 - 2025/06/14 (土) 16:32:48 - 774R 複数の波形が重なったようなシーケンス結果が得られ、再度シーケンスしても同様で、さらに他のコロニー由来プラスミドでも同様の結果だったがあります。 まれに、知らずに複数のコロニーがまぎれる可能性もあるかもしれませんが、その場合、別のコロニー由来のプラスミドでシーケンスし直すか、元のコロニーを再度白金耳で引いてシングルコロニーにしてから行うなどすれば解決すると思われます。 私が経験したのは、たまたまインサート内の配列がシーケンスプライマーとのホモロジーが高く、そこからのシーケンス波形が混じった考えてます。

トランスフォーメーションについて 削除/引用 No.12997-1 - 2025/06/14 (土) 14:24:06 - はる 現在ある遺伝子を搭載したベクターを作製中です。トランスフォーメーション後、LB培地にまき、形成したコロニーをピックアップ、ミニプレップ後にシーケンス解析したのですが、配列がバラバラでした（複数DNAが混在したような配列）。単一コロニーをピックアップしたときにこのような結果がでたのは初めてです。 コンタミが疑われますが、このような場合、再度トランスフォーメーションをすればいいのでしょうか？ またこのような結果になったことある人いましたら、対処法をご教示いただきたいです。 よろしくお願いいたします。

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