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(無題) 削除/引用 No.12992-5 - 2025/06/13 (金) 15:18:21 - drftghy 大腸菌などでに外来タンパク質を発現、産生させて培地やペリプラズムに分泌させるのとは異なり、培養細胞が分泌したタンパク質は培地中ではFBS由来のタンパク質と比べると量的には圧倒的に微量であることが多く、血清を含むconditioned medium(CM)を濃縮したものをサンプルとして電気泳動した場合、事実上、大量の血清タンパク質を強引に泳動したのと同じことになります。泳動パタン自体も乱れますしアルブミンは量が多いと広がってとくに下のほうが濃くなったりするので、電気泳動での50~60KDaとかの間の違いで分子量の変動を論じるのはあまり意味がありません。また濃縮や添加量にも限度がありますので、見たいタンパク質もうまく見えないことが多いです。 通常、conditioned medium (CM)中の分泌タンパク質の分析では無血清培養でCMをある程度の量（50~1000ml)に集めて、（特に生物活性を保持したいならば）硫安濃縮法などで濃縮し、透析などで脱塩してから実験に用いることが多いです。膜（限外濾過膜）による濃縮は便利ですが、微量タンパク質の場合は膜への吸着により大幅にロスする場合がありますし、対象物の分子量が限界分子量に割と近いとタンパク質分子の形状によっては抜けてしまうこともあり、回収率は必ずしも高いくないこともよくあります。CMについては一度に集めることが難しい場合は何回かに分けて培養しその都度CMを−80℃で保存し、ある程度集まったら濃縮します（凍らすと培地の色が黄色っぽくなることがありますが、再融解するとまた赤っぽくなります。）無血清培養が細胞の生存や研究結果に影響する恐れがある場合は、必要なトランスフェリンや増殖因子や接着因子などを選択的に添加することもできます。

(無題) 削除/引用 No.12992-4 - 2025/06/13 (金) 15:09:08 - Y 大腸菌などでに外来タンパク質を発現、産生させて培地やペリプラズムに分泌させるのとは異なり、培養細胞が分泌したタンパク質は培地中ではFBS由来のタンパク質と比べると量的には圧倒的に微量であることが多く、血清を含むconditioned medium(CM)を濃縮したものをサンプルとして電気泳動した場合、事実上、大量の血清タンパク質を強引に泳動したのと同じことになります。泳動パタン自体も乱れますしアルブミンは量が多いと広がってとくに下のほうが濃くなったりするので、電気泳動での50~60KDaとかの間の違いで分子量を論じるのはあまり意味がありません。また濃縮や添加量にも限度がありますので、見たいタンパク質もうまく見えないことが多いです。 通常、conditioned medium (CM)中の分泌タンパク質の分析では無血清培養でCMをある程度の量（50~1000ml)に集めて、（特に生物活性を保持したいならば）硫安濃縮法などで濃縮し、透析などで脱塩してから実験に用いることが多いです。膜（限外濾過膜）による濃縮は便利ですが、微量タンパク質の場合は膜への吸着により大幅にロスする場合がありますし、対象物の分子量が限界分子量に割と近いとタンパク質分子の形状によっては抜けてしまうこともあり、回収率は必ずしも高いくないこともよくあります。CMについては一度に集めることが難しい場合は何回かに分けて培養しその都度CMを−80℃で保存し、ある程度集まったら濃縮します（凍らすと培地の色が黄色っぽくなることがありますが、再融解するとまた赤っぽくなります。）エネルギー代謝の研究などで無血清培養が研究結果に影響する恐れがある場合は、必要なトランスフェリンや増殖因子や接着因子などを選択的に添加することもできます。

(無題) 削除/引用 No.12992-3 - 2025/06/10 (火) 23:29:22 - おお https://www.researchgate.net/figure/Analysis-and-identification-of-the-environmental-protein-contaminants-Silver-stained-SDS_fig2_6185847 Analysis and identification of the environmental protein contaminants. Silver stained SDS gel of blank and dust samples. Lanes 1-3 show blank samples containing sample buffer and 35 mM DTT. Lane 4 shows proteins extracted from 25 μg of normal environmental dust in sample buffer containing 35 mM DTT. The upper band (about 65 kDa) is keratin-1 and the lower band (60 kDa) is keratin-10. 泳動などでケラチンが交じることは常で、MSでも必ず検出されるくらいです。それが濃縮されたのかもしれませんが、でも私hはBSAを疑ってしまいます。血清抜きのようで血清が入っていた培地から血清を抜いた培地に洗って交換したのかもしれませんが、血清には１uあたり３０ug以上のアルブミンが含まれてます。細胞のLysateを取るときにPBSで２回ぐらいあらってもSDSPAGEでCBB染色とかすると痕跡と思われるバンドが現れます。要するにそう簡単に抜けきれない。 でアルブミンだとすると、量的に多くてバンドが下に太っていて少し小さく見えているのではと思います。かなりの蛋白が量を増やすにつれてSDSPAGEでバンドが下に太ってきますなのでそういう場合はバンドの上の部分で分子量を判断するのが一般的です。

(無題) 削除/引用 No.12992-2 - 2025/06/10 (火) 23:25:42 - qq ＞DMEM（FBS-,Lグルタミン＋、ピルビン酸＋、フェノール−） つまり、FBS不含なのですよね。 想像できないけど、培地だけを濃縮しても出るのですか？ 培地だけを濃縮したのではなく培養上清を濃縮したのであれば、培養した細胞次第ではないかな？

培地濃縮後のクマシで50kDaにある濃いバンドは何？ 削除/引用 No.12992-1 - 2025/06/10 (火) 21:03:01 - Mitoma DMEM（FBS-,Lグルタミン＋、ピルビン酸＋、フェノール−）の培地をAmicon Ultra で 10K濃縮して、CBB（Coomassie Brilliant Blue）染色した際に50 kDaあたりに強いバンドが出ます。何のバンドでしょうか。アルブミンもコントロールで流しており、それとkDaは違うので、アルブミンではありません。 同じ経験のある方がいれば、可能性のある候補を教えていただければ幸いです。

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