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(無題) 削除/引用 No.12975-15 - 2025/06/17 (火) 01:29:49 - おお >[Re:11] oyajiさんは書きました : > ある程度、DNAの量が欲しい、組み換え、トランスフェクションをするなら、１６程度なら大した仕事量ではありません。 まあね、そう言っちゃあそうだけど、それぞれ環境にもよるわけだから、たとえばプラスミドを取るのにあまり時間を割いていられない人もいるわけで。 プラスミドのConstructionをするのなら、単純なものであれば４、５個ひろえばあたりが拾えるくらい効率を工夫したりはしてましたけどね。

(無題) 削除/引用 No.12975-14 - 2025/06/17 (火) 01:24:16 - おお う さんありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12975-13 - 2025/06/16 (月) 15:56:35 - う これです。洗いの最終回の後に一度遠心してから溶出しないといけません。それがめんどいです（私は） https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/vacuum-manifolds-and-accessories/qiavac-accessories

(無題) 削除/引用 No.12975-12 - 2025/06/16 (月) 13:40:20 - う ＞ちなみにどのマニフォールドをお使いですか？ プラスチックの青い水道管みたいなやつです。 バキュームで吸いながら15mLの文中ピペットで洗ってます。

いろいろかと 削除/引用 No.12975-11 - 2025/06/16 (月) 07:35:51 - oyaji シークエンスするだけなら、いきなりPCR・・・直接シークエンス。 安価に１６なら、２mlチューブで培養し、アルカリ、あるいは煮沸法で抽出し、アタリクローンをフェノクロ再抽出かカラム抽出かも、、、。 ある程度、DNAの量が欲しい、組み換え、トランスフェクションをするなら、１６程度なら大した仕事量ではありません。ピペットの本数を増やすと、速くなります。（私は一人で６本。）アガロースゲルを多数作成する、制限酵素をPCRチューブでやる、増殖の速い大腸菌（拾って同日ミニプレップ）など、色々とアイデアはあるかと。 カラムですと、日本ジェネティクスのキットが速いです。プロメガのキットだと、集菌なしで抽出できると聞いてます。プロメガの先生は一日２００プレップと聞きました。１６程度なら、多いとは言えないでしょう。クラボウなど、機械や用具もあります。後は成功率を高くする。マーカー遺伝子を入れ、蛍光色で成功クローンを同定するなどかと。

(無題) 削除/引用 No.12975-10 - 2025/06/03 (火) 22:59:25 - おお >[Re:9] うさんは書きました : > バキュームの方がずっと楽です。 > ローターからチューブを出して、液を捨ててまた戻して、というのが私は面倒臭くて、バキュームで分注ピペットで洗浄液を入れていくだけのの方がずっと楽だと思ってます。あくまで主観ですけど。 ちなみにどのマニフォールドをお使いですか？

(無題) 削除/引用 No.12975-9 - 2025/05/29 (木) 17:46:01 - う バキュームの方がずっと楽です。 ローターからチューブを出して、液を捨ててまた戻して、というのが私は面倒臭くて、バキュームで分注ピペットで洗浄液を入れていくだけのの方がずっと楽だと思ってます。あくまで主観ですけど。

(無題) 削除/引用 No.12975-8 - 2025/05/29 (木) 12:13:35 - G25 カラムをやめて塩析（P3)後の上清をアルコール沈殿すればいいのでは。 すべて自作の試薬でできるのでキットを買う必要もない。 サンガーシークエンスならそれで十分。

(無題) 削除/引用 No.12975-7 - 2025/05/29 (木) 08:47:03 - mont バキュームは、確かにコツというか、注意深く観察する人向きかもしれません。 バキュームの強さが適切かどうかが判断出来ないと、失敗するかも。特に自作したりする場合は。 溶液が吸引されるスピードで、どこか漏れてるな、とわかるのですが、わからない人にはわからないようです。 私の環境では、空気漏れがなければ、カラムを満タンにしても、3−5秒ぐらいで吸い込まれます。 カラムの数が増えれば、当然ながら少し遅くなります。 空気漏れがなければ、断然早くて便利だと思うのですが、QIAGENの青いヤツは、付属のキャップが小さくてすぐ無くすのと、内部を洗うための栓とキャップが壊れやすいのが難点(ウチのラボでは、随分昔に壊れ、10ミリシリンジの内筒を突っ込んで栓にしています)。付属のキャップはラボで使っているPCRチューブの底がピッタリ合ったので、無くした分は代用。あと、QIAGENの青いヤツ、無駄にデカいです。でも、カラムの先と穴はよくフィットして、全体の作りは頑強。ウチのラボで使っているのは、多分20年ぐらい前のモデル、今はもっと良くなっているのかと思ったら、見た目はほぼ同じですね。コネクターは、キャップと同じで、多分すぐに紛失し、PCRチューブの底で塞ぐことになりそう。本体横のキャップも、何度も開け閉めしているうちに簡単に壊れると予想します(シリンジ内筒で塞ぐことになりそう)。ラボの共有機器、無くなるのが当たり前、壊れるのが当たり前なので。 https://www.qiagen.com/us/knowledge-and-support/knowledge-hub/explainer-videos-and-demos/plasmid-high-yield-protocol

(無題) 削除/引用 No.12975-6 - 2025/05/29 (木) 07:40:54 - すしお アルコール沈殿の方が手数が少なくて楽なので私もそうしています。チューブの容量ギリまで液が入ることを嫌って、EtOHではなく2PrOHを使っています。シークエンスが目的ならこれで十分です。

(無題) 削除/引用 No.12975-5 - 2025/05/29 (木) 07:38:46 - 1リットル プラスミド全長読む場合は抽出精製していますが、部分的に読む場合はプラスミド抽出精製せずにコロニーPCRしたものをサンガーシークエンスしています。

(無題) 削除/引用 No.12975-4 - 2025/05/29 (木) 01:50:04 - おお わたしもカラム意外とめんどくさいなとおもって、アルカリ法、エタ沈をキットに頼らずやったりしてます。P3入れたあとの遠心後に同量の３００mM Na acetateを含む飽和尿素を加えてエタ沈するとそこそこきれいになります。 バキュームは一度提案したことがあったのですが他の方のコメント見ると不評でした。メンテナンスやコツなどがあるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12975-3 - 2025/05/29 (木) 00:31:29 - mont 買えるならバキュームお薦めです。 あるいは、すでにあるバキュームを試して、必要なら修理する。 ガムテープがベタベタ貼られているのは、誰かが穴を塞ぐために苦戦した後なのだと思います。スピンカラムを装着する穴を塞ぐためのキャップは、小さい部品なので、皆あっという間に無くしてしまいます。 要は真空性を保てれば良いだけの話なので、ガムテープで塞ぐでも良いのですが、あまりスマートな方法ではないですね。 「使わないスピンカラムを装着する穴」を塞ぐためには、運が良ければPCRチューブの底がピッタリはまるかもしれませんので、試してみてください。私はすでにあるキャップを複製し、塞いでいます。あるいは、型取り用シリコン（白と青の粘土のようなやつを混ぜると固まるシリコン。硬めの型取り剤が使いやすいです）を押しつけて、新たにキャップにするでも良いかと。 私は、頑丈そうなパッキン付きタッパーにドリルで穴を空けて、バキュームを自作して使っています（小さいサイズが欲しかったので）。 穴は、上述のシリコンで、スピンカラムにフィットするようにします。 割れなどの穴は、シリコンやUVレジンなどで塞ぐ。100円ショップや、手芸店、模型店などで手に入るはずです。 キャップの複製方法 上述の型取り用シリコンで型をとる。 ２液性レジンを流し込んで複製。 バキュームが弱い（どこかに漏れがある）と、精製度が下がります。 溶液を加えると、数秒（長くて５秒ぐらい？）以内に吸い込まれるハズで、エタノール溶液で洗った後は、３−５分ほどバキュームを継続してよく乾燥させます。 溶出液を加えて遠心した後に、液量が増えてしまう場合は、エタノールの乾燥が不十分、おそらくバキュームが弱い、どこかに漏れがある可能性があります。

miniprepの作業量を減らす工夫 削除/引用 No.12975-1 - 2025/05/28 (水) 22:21:51 - たく お世話になります。 月に数回、16コロニーほどをminiprepしてプラスミドを抽出しています。 方法はP1からP3を使ったアルカリ方法で、精製はスピンカラムを使っています。 毎回遠心機から取り出して、洗浄液を入れ、遠心という操作を三回ほど繰り返さねばならず、なかなかの労力です。 学生ならそれでもよいかもしれませんが、雑務が多い教員となるとどうにか工夫できないかと思案してしまいます。 バキュームする器具はラボにはありますが使ったことはありません。たぶんガムテープがベタベタ貼られており壊れていそうです。 また、遠心寺に受け側のチューブを使わず、カラムのみを遠心して、フロースルーは遠心機に付属した受け皿で回収するというのもみたことがあります。 購入するならどちらがおすすめでしょうか？ あるいは先生方で、作業量を減らす工夫をされてる方がいらっしゃればシェアいただけましたら幸甚です。 miniprepの目的は精製したものをサンガーシークエンシングで配列解析することです。

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