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(無題) 削除/引用 No.12967-6 - 2025/05/24 (土) 17:16:32 - qq HPLC　様 ＞大腸菌である酵素を発現させ、基質と反応させた溶液をHPLCで分析し、 ＞生成物の定量する実験を行っています。 基質と生成物は、低分子化合物だと考えて良いのですか？ 反応液をHPLCにinjectする前に何か前処理はあるのでしょうか？ HPLCと言っているので、C18やC8を想像してよいのでしょうか？ 検出器はMSですか、それともUVや蛍光ですか？ というような疑問が湧いてきます。

(無題) 削除/引用 No.12967-5 - 2025/05/24 (土) 14:57:29 - おお HPLCの再現性自身を気にするならスタンダードを流すとかすればわかると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12967-4 - 2025/05/24 (土) 14:41:57 - おお >グリセロールストック→固体培地（単コロニー） そうですね。 たとえば大腸菌で発現させるのではなく他の目的のプラスミド（哺乳動物細胞とかイーストで使うとか）を持った大腸菌でもグリセロールストックからコロニーを介さず培養すると極端に収量がおちたり、そのうちプラスミドが取れなくなったりします。このことについて深く原因を調べたわけではないですが、耐性遺伝子だけ菌体内で保有したまま（どういうふうにかわかりませんが）目的の遺伝子が抜けていっているような印象を持っています。でそういうのが培養中にドミナントになると、目的のプラスミドをもった菌の割合が少なくなってしまいます。pETのような大腸菌で発現するようなプラスミドでも同じようなことが起きます。 スタートの時点でプラスミドを持った菌体だけにしておくことが必要かなと思うわけです。

(無題) 削除/引用 No.12967-3 - 2025/05/24 (土) 14:24:49 - HPLC おお様、ご回答ありがとうございます。 確かに、年単位で少しずつ減っているという報告が研究室内でありました。 これまでのプロトコルでは、 グリセロールストック→前培養（30℃、18時間）→本培養（30℃、6時間）→誘導培養（IPTG、16℃、15時間）、、、 という流れでやっていましたが、 グリセロールストック→固体培地（単コロニー）→前培養（30℃、18時間）、、、 という工程を踏んだ方が良いということでしょうか。 余談ですがこれをすることで菌体にどのような変化があるのでしょうか。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.12967-2 - 2025/05/24 (土) 14:10:20 - おお グリセロールストックからコロニーを拾わずに培養すると、発現量がストックの期間におおじて減ってきませんか？ 発現している酵素の量を調べず酵素活性だけで判断するのはちょっと片手落ちにような気がします。

HPLCの再現性について 削除/引用 No.12967-1 - 2025/05/24 (土) 13:52:07 - HPLC お世話になっております。 HPLCの再現性についてのアドバイスをいただきたくスレを立ち上げさせていただきました。 現在、大腸菌である酵素を発現させ、基質と反応させた溶液をHPLCで分析し、生成物の定量する実験を行っています。 しかし、実験を行うたびに生成物量が異なってしまい、またその原因が分からず困っています。 大腸菌は毎回グリセロールストックから液体培地に植菌し、前培養・本培養を行ってから菌体量を計測して濃度を揃えることで、各サンプルの菌体量を均等にしています。1つ原因として考えているのは、一連の操作の中で外部要因の差異（振盪培養器の空調など）が積み重なり、菌体一つあたりが発現する酵素の量が変化してしまうことです。 何か参考になる文献等ございましたらご教授いただけると幸いです。 経験則に基づいたアドバイスでも頂けるととても嬉しいです。 何卒よろしくお願いいたします。

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