>[Re:12] Icanさんは書きました :
> ありがとうございました。
>
> このあたりも、何故かタンパク質の不安定性や発現差の話には言及はないんですよね。これだけ発現差があれば、レビューアーから指摘が入ってもよさそうですが。。。そもそもレンチウイルスで発現させると発現差は結構出たりするものなのでしょうか。
タンパク量についてはDNとして働いていればあなたの実験の本質ではないとお見受けしますので、そこが示せればいいのだと思います。
レンチだからどうかと言われると、個人的にはそうではないような気がします。ただしゲノムにインテグレートされるわけで、そこから増殖させて使うという点ではステイブルなCell lineをつくったということになります。懸念としてはRasは増殖に関するタンパク質なので、そのDNを入れて増殖が抑制傾向になれば強い発現のものは飼っている間に減ってくるかもしれません。それで落ち着いたものがそれぐらいの発現量の細胞だった可能性はあります。プラスミドのトランジェントのほうがより発現が得られるかもしれませんし、毎回感染してすぐ使うとましになるかもしれません。またTet誘導性にしておけば微量で強い効果がないのであれば有用かもしれません。
安定性に関してはすでに述べましたようにおそらくあなたの実験の本質でないでしょうけど若干の考察など含めると良いでしょう。蛋白の安定性に関しては例えば結晶構造、NMRとかの構造解析など見てみてFree Energy的にどの程度差があるかとか、どのように構造に寄与していることがわかっているかとか。WTへのスーパーインポーズでもいいかもしれません。また過去の論文からいろいろな系でWTやConstitutive activeに比べて少ないなどのコメントを加えておくとか。
ちょっとやってみる程度ならたとえばプロテアソームインヒビターなどでユビキチンのつき具合とかみるとか、Rasについて分解に関与する酵素のをしらべてそのインヒビターをつかってWtと比べるとか、比較的簡単な系で分解に関してとっつきになるぐらいのものがあればよりいいかもしれませんね。
DNとかいろいろあるでしょうけど、たとえばp５３のDNは従来のp５３の癌抑制遺伝子からがん遺伝子に変化したと言えるもので、p５３DNはwtのp５３より遥かに安定です。 |
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