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qPCRのコントロールサンプルが発現しない時の定量法 トピック削除
No.12951-TOPIC - 2025/05/12 (月) 18:10:31 - う
例えば、サンプルA（コントロール）とB、Cでハウスキーピング遺伝子（HKG）とターゲット遺伝子（TG）をqPCRで検出します。
その際に、AとB、Cの全部でHKGは検出できましたが、AではTGが検出できず、BとCでは検出できたとします。

その際、ΔΔCtですと、Aで検出できていないので、相対値が出せないと思います。

私としては、Aは検出できず、BとCは検出できたというデータを示したいとします。（BはAの何倍等は必要ない）

この場合、何かしら定量法などはありますでしょうか？

例えば、ΔCtを使って、2^-(ΔCt)の値をそれぞれ出して、
AはN.D.、BとCはそれぞれの値をプロットするというのも出来なくは無いのかなと思っています。（この数値の絶対値自体に意味はありませんが、BとCのどちらが発現量が高いか等の評価は出来ると思っています）

ご助言をいただけますと幸いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.12951-5 - 2025/05/14 (水) 05:43:56 - おお
>[Re:4] かんさんは書きました :

> 50cycleまわしてもThlesholdとの交点ができないぐらい増幅曲線が立ち上がってこないということで、そのサンプルについてCt値はかなり大きい、たとえば50とかに設定してしまう。
> Methodsに、Ct値は交点が無い場合PCRサイクルを行った50として解析を行った、と記載しておけばよいと思います。

４０サイクル以上はあまり意味をなさないとされてます。
まず原理的に４０サイクルも回せば１コピーを検出できます。だから更に回したからといってなんなのということ(むかし実際にエチブロの感度で自分で計算すると３５サイクルぐらいになった)。

また４０サイクル以上のCtは実験の性質によるかもしれませんが、大抵の場合信用に値しません、スペシフィックでないなどの理由で。加えて酵素活性がいつまで持つかという視点で何ら確証がありません。

ということで、もし１コピーのCt値が決めれるならば（実際に１コピーの増幅かまたはコピー数で検量線引いて）、それより大きい（大きくて決められない）なら０コピーと言えるから発現量０と言えるのかもとちょっと思いました。

(無題) 削除/引用
No.12951-4 - 2025/05/13 (火) 13:00:27 - かん
delta deltaで定量しにくい、という点を解消するひとつのほうほうとして、以下いかがでしょうか？
50cycleまわしてもThlesholdとの交点ができないぐらい増幅曲線が立ち上がってこないということで、そのサンプルについてCt値はかなり大きい、たとえば50とかに設定してしまう。
Methodsに、Ct値は交点が無い場合PCRサイクルを行った50として解析を行った、と記載しておけばよいと思います。

(無題) 削除/引用
No.12951-3 - 2025/05/12 (月) 23:24:56 - おお
> この数値の絶対値自体に意味はありませんが、

コントロールがNDであるのは意味があります。相対値ですから例えばWBでバンド定量してもその数字自体は具体的なユニットでのを示しているわけではないわけで、そこにこだわる必要はないかと。

(無題) 削除/引用
No.12951-2 - 2025/05/12 (月) 23:18:20 - おお
2^-dCでグラフを書くとしてコントロールはNDとしておくぐらいでしょうか。

エンドポイントのPCRでエチブロなどで染めてsemiquantification としてバンド定量なら、バンドがなくても数字は出せますから統計処理は一応できます。

qPCRのコントロールサンプルが発現しない時の定量法 削除/引用
No.12951-1 - 2025/05/12 (月) 18:10:31 - う
例えば、サンプルA（コントロール）とB、Cでハウスキーピング遺伝子（HKG）とターゲット遺伝子（TG）をqPCRで検出します。
その際に、AとB、Cの全部でHKGは検出できましたが、AではTGが検出できず、BとCでは検出できたとします。

その際、ΔΔCtですと、Aで検出できていないので、相対値が出せないと思います。

私としては、Aは検出できず、BとCは検出できたというデータを示したいとします。（BはAの何倍等は必要ない）

この場合、何かしら定量法などはありますでしょうか？

例えば、ΔCtを使って、2^-(ΔCt)の値をそれぞれ出して、
AはN.D.、BとCはそれぞれの値をプロットするというのも出来なくは無いのかなと思っています。（この数値の絶対値自体に意味はありませんが、BとCのどちらが発現量が高いか等の評価は出来ると思っています）

ご助言をいただけますと幸いです。
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