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ありがとうございました 削除/引用 No.1295-18 - 2013/01/09 (水) 15:58:18 - たぐたぐ harmoniaさん、なでしこ組さん コメントありがとうございました。 確かにRやKの多いヒストンとDの多いFLAGの挙動には気をつけないといけませんね。 おっしゃる通りだと思います。 ががさん クロスリンク時に確かにFLAGはやっかいですよね。HAなら少しましかなと思ってはいましたが… Ty1 tagというのは知りませんでした。ありがとうございます。 みなさまのご教示に感謝致します。

(無題) 削除/引用 No.1295-17 - 2013/01/07 (月) 23:00:57 - なでしこ組 >感覚的な話ですけどね。経験談ではありません。 こういう捉え方は大事ですよ。 感覚的とは言っても、FLAGタグとヒストンのアミノ酸配列の類似性という裏付け があって、ヒストンとDNAの複合化の駆動力である静電相互作用に影響しそうだ と原理を理解して考えれば、FLAGタグがクロマチン構造の形成に影響を与えてし まってNativeな現象を歪めてしまうかもしれないと考えるのは賢明です。 免沈ができるかどうかより、その上流の過程でクロマチン構造に影響があったら、 何を見ているか分からないしね。

(無題) 削除/引用 No.1295-15 - 2013/01/07 (月) 21:17:21 - Harmonia No.1295-14 - ががさん フォローというよりは、修正をして下さいました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1295-14 - 2013/01/06 (日) 20:36:39 - がが なるほど、感覚ね。。。。トビ主さんが、そのコメントで惑わされてるな。。。。 クロマチンのChIp assay等の際に細胞をクロスリンクしますよね。その際Lysはクロスリンカーと反応します。Lysとのクロスリンクが抗体との反応を阻害するんです。なので、ChIp assayの際はLysを含むタグ（FLAG, Myc, STREP)はIPの効率がよくありません。クロスリンクをかます実験ならLysを含まないTy1 tagがお勧めです。

(無題) 削除/引用 No.1295-13 - 2013/01/06 (日) 18:37:28 - Harmonia 感覚的な話ですけどね。経験談ではありません。 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys っていう配列が、電気的に偏りの強い 配列な気がするので、同じく偏りが強いヒストンがらみの実験だと、惑わ されそうで。

追加です 削除/引用 No.1295-12 - 2013/01/05 (土) 09:52:02 - たぐたぐ 一端閉じてしまったのですが、 その後でメールをいただいたので再度書き込ませていただきます。 すみません。 ＞Harmoniaさん 「FLAGの配列を見ていると、クロマチンがらみの実験は、危険が伴うと思う」 というコメントをいただきましたが、なぜ危険なのか教えていただけませんでしょうか。クロマチンがFLAGに非特異的についてきてしまうという意味ですか？ （直接Harmoniaさんにメール送信ができなかったのでこの場をお借りしております。）

(無題) 削除/引用 No.1295-10 - 2013/01/02 (水) 09:40:24 - える 私のタンパクは3xFlagにしてプルダウンの回収率がとても向上しました。 1xの時はほとんど上清に残っていましたが、3xにしたらほとんどがプルダウンされるようになりました。別のタンパクですが、3xしたところウエスタンのバンドがくっきり見えるようになりました。 逆に、抗体ビーズから溶出する際、1xFlag合成ペプチドでは溶出されず、3xflag合成ペプチドを使わなければ行けないとシグマのサイトに書いてあったように思います。

(無題) 削除/引用 No.1295-9 - 2012/12/31 (月) 19:50:24 - はた タンデムリピートだと、解離した次の瞬間にエピトープに再び結合する確率が増えるので、見かけのkoffが大きく減るからだろうと思います。一つのエピトープから離れたときに他のエピトープに囲まれるようになるので。結果的に、解離定数が低くなって、加えた抗体のうち、結合できる分子数が増えるのじゃないですかね。

(無題) 削除/引用 No.1295-8 - 2012/12/31 (月) 14:16:08 - おお >[Re:6] たぐたぐさんは書きました : > みなさま > コメント、情報ありがとうございます。 > > 1xFLAGではなかなか抗体に認識されにくい場合があって、 > 3xFLAGにすることによって、構造上抗体に認識されるチャンスが３倍以上に増える、ということなんでしょうか・・・。 > > 構造が絡まなくても抗体ｰ抗原のコンプレックスの安定性が上がるということも考えられるのではないですか?エピトープ部位が 3つと、抗体自身が2か所の認識部位を持つのでかなりコンプレックスは複雑になる可能性がありますが、1対1のアフィニティーでは説明できませんよね。

(無題) 削除/引用 No.1295-7 - 2012/12/31 (月) 13:47:34 - aji 下記論文には別の配列ではありますが、エピトープの繰り返しを増やすことでアフィニティーが上がることがSPRで示されています。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2590912/ さらなる改良版も http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20566373

(無題) 削除/引用 No.1295-6 - 2012/12/31 (月) 13:26:13 - たぐたぐ みなさま コメント、情報ありがとうございます。 1xFLAGではなかなか抗体に認識されにくい場合があって、 3xFLAGにすることによって、構造上抗体に認識されるチャンスが３倍以上に増える、ということなんでしょうか・・・。

(無題) 削除/引用 No.1295-5 - 2012/12/31 (月) 01:32:40 - おお http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/cloning-and-expression/vector-systems/mat-system-vectors/3x-flag.html 1XFLAGと比べて3倍よりはるかに感度が上がっているので、数だけで説明がつかないですよね。

(無題) 削除/引用 No.1295-4 - 2012/12/30 (日) 17:36:46 - CAP 質問文を読むと、抗FLAG抗体との「結合」が強くなるかどうかということをお尋ねでしょうか？ 検出感度が上がるのは結合する抗体の「数」が増えるからであって、単一の抗原抗体反応自体は変わらないように思いますが、どうなのでしょう？

(無題) 削除/引用 No.1295-3 - 2012/12/29 (土) 23:54:44 - フラグ もちろん強くなります。経験も沢山あります。IgGは二価ですから。

(無題) 削除/引用 No.1295-2 - 2012/12/29 (土) 23:54:29 - おお シグマによると、3xFLAGはFALGの３倍よりはるかに強い(たしか2オーダーに近いぐらい)WBの検出力が得られるようです。

FLAG tag 削除/引用 No.1295-1 - 2012/12/29 (土) 18:49:54 - たぐたぐ いつも勉強させていただいております。 FLAG tagについて教えていただきたいのですが、 3xFLAGの形で発現させた場合、1xFLAGよりも、 FLAG抗体（付きビーズ）との結合は強くなるのでしょうか。 実際に結合が強くなり実験結果が改善された、という ご経験のある方がいらっしゃいましたら教えていただけますでしょうか。 宜しくお願い致します。

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