BioTechnicalフォーラム [PCRでのMgとMnの共存]

全32件 ( 21 ～ 32 )　前 | 次　1/ 1. 2. /2

(無題)

No.12947-12 - 2025/05/12 (月) 21:55:42 - おお

RTでノンスペが減らせる対処法としては、大抵はオリゴdTの方がテンプレートの複雑性が減りノンスペがが減る可能性が高いです。さらに言うとスペシフィックプライマーの方がより特異性が確保できます。スペシフィックプライマーを使う時はもしリファレンスのcDNAが必要ならそのスペシフィックプライマーも加えておくと言う手もあります。オリゴdT+スペシフィックでも改善するかもしれません。

正しいPCRのアンプリコンに対するミスアニーリングによるノンスペはRTで改善しようとしても効果がないでしょう。

(無題)

削除/引用

No.12947-11 - 2025/05/12 (月) 16:44:05 - Ca

おお様、G25様

ご助言ありがとうございます。
また、お返事が遅くなりました。

自分の方でも実際にMn, Mg濃度を様々振って
検討をしてみました。
結果はG25様がおおむねおっしゃる通りで、
MnとMgを添加しても非特異は発生しました。

20測定だけですが、Mgを添加したほうが、さらに非特異が
多くなるようなことはなかったという結果です。

さらに別検討をするとRT中に悪さが起こってる
ということが分かりました。
RTを短縮することで非特異がなくなっています。

提示した文献が間違っていたのは申し訳ありませんが、
文献に沿ったデータが得られました。

使用している酵素のフィデリティーは分かりませんが、
一般的なTthのフィデリティーは通常使用される酵素よりも
フィデリティーが低いようです。

(無題)

削除/引用

No.12947-10 - 2025/05/09 (金) 14:46:30 - G25

>rNTPに対しても十分なアフィニティを与えるのでRT反応に使えるし、

RTだから基質はrNTPじなくてdNTPですね。勘違い。

いずれにせよ酵素とdNTPの結合が促進されるとmisincorporationが増えるというのは、校正活性のないTaqでは変異率が上がらないようにdNTPの濃度を0.2 mM each以下にしろというのや、epPCRで特定のdNTPの濃度だけ上げるということの根拠。

一方、Mg++やMn++はポリメラーゼとdNTPとのアフィニティーを高めるということの他に、duplexを安定化させるという作用もある。濃度を高くするとアニーリングしやすくなって増幅効率が上がるが、非特異的プライミングが起きやすくなる。あなたの言う、非特異的産物という問題はmisincorporitionの結果じゃなくて、mis-annealingのせいでしょう。これも作用の方向性は同じなのだから、Mn++の作用をMg++で中和することはできない。

(無題)

削除/引用

No.12947-9 - 2025/05/09 (金) 01:33:39 - おお

>[Re:6] Caさんは書きました :
> おお様

> Mnのせいで非特異産物が発生しやすくなっていることに関して、
> https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10466794/
> という論文もありますし、
> 様々なサイトでMgよりもMnの方が変異発生率が上昇することが記載されています。

ちょっとまって。あなたの言う非特異産物っていうのはPCRでプライマーのミスアニーリングによってできる、アンプリコンと関係ない産物（大抵長さがちがう）ではないの？普通はそう捉えますよ。示された文献はそういうことではないですよね。

で、TthによるRTの際の変異を減らしたいということなんですか？それなら話が違ってくる。TthによるRTのフィデリティーは一般にどれくらいと言われてますか？

(無題)

削除/引用

No.12947-8 - 2025/05/09 (金) 01:16:23 - おお

>[Re:7] G25さんは書きました :

> Mn++も役割としては同じだと思っています。ただMn++のほうがMg++よりむちゃくちゃアフィニティーを高めるので

アフィニティーが気になってたので勉強になりました。Mnイオンのほうが強いならMgで入れ替えようとしてもかなり過剰に必要になってくるし、機能を考えると単純にMgましましにしたときと変わらないということですね。要するにうまくいく条件にMgを更に加えてノンスペを増やすような印象。

(無題)

削除/引用

No.12947-7 - 2025/05/08 (木) 19:09:50 - G25

PCRにおけるMg++の役割はpolymeraseと複合体を作ってdNTPとのアフィニティーを上げること、その結果、伸張活性を促進することです。
Mg++濃度を高めると増幅効率が上昇する一方、非特異的産物ができやすくなるというのもそういうことです。

Mn++も役割としては同じだと思っています。ただMn++のほうがMg++よりむちゃくちゃアフィニティーを高めるのでTthなんかではrNTPに対しても十分なアフィニティを与えるのでRT反応に使えるし、通常のPCRではmisincorporationが起こりやすくなるのでしょう。

つまりMg++もMn++も作用の方向は同じで強度が違うだけ。
Mn++によって生じた非特異的増幅をMg++によって中和することはできないばかりか、Mg++濃度が上積みされてよりひどくなることでしょう。
塩辛い料理に醤油を加えて味を整えようとするようなもの

(無題)

削除/引用

No.12947-6 - 2025/05/08 (木) 16:57:19 - Ca

おお様

ご助言ありがとうございます。

非特異が出た場合、金属イオン濃度を下げることは承知しています。
しかし、Mn濃度を下げるとqPCRにおいてCq値が遅れることは確認しています。

Mnのせいで非特異産物が発生しやすくなっていることに関して、
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10466794/
という論文もありますし、
様々なサイトでMgよりもMnの方が変異発生率が上昇することが記載されています。

そこで、Mgを入れることによってPCR中の変異発生率を
低下できないかと考えております。

(無題)

削除/引用

No.12947-5 - 2025/05/08 (木) 06:26:41 - おお

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/%28SICI%291097-0061%2819980115%2914%3A1%3C89%3A%3AAID-YEA194%3E3.0.CO%3B2-3

ああ、変異導入で使われるからってことですかね。Mn＋Mgで上記の文献PCRしてますけど、Mnのみと変異の導入はあんまり変わらなそうです。A to Gの変異だけが顕著に下がってますかね。

https://www.toyobousa.com/lifescience-tth-dna-polymerase.html

東洋紡のプロトコールではEGTAでキレーとしてMgのはいったバッファーでPCRに持ち込んでいるようです。

どのようなプロトコールを使っているかわかりませんがMnの影響をさげるならEGTAを利用するとか、PCRに持ち込む量を減らすとかでしょうか。１ステップでやっているなら手間が増えるかもしれませんが、EGTA（＋Mg)入れるぐらいならそこまで出ないかなと思います（じっさいにMg入れようとお考えのようだし）。

でもそれでノンスペが減るという保証はありませんけど。

(無題)

削除/引用

No.12947-4 - 2025/05/08 (木) 02:26:40 - おお

>Tthの逆転写にはMnが必須ですが、このMnのせいで非特異産物が
発生しやすくなっていると推測

この根拠は何でしょうか？そういう可能性があることがすでに指摘されているのでしょうか？MnとDNAのインターらクションなどを疑っているのでしょうか？

(無題)

削除/引用

No.12947-3 - 2025/05/07 (水) 16:57:18 - おお

もしできるなら、エタチンとかしてMn 非存在下でちゃんとかかるか確認してみてもいいのでは？

(無題)

削除/引用

No.12947-2 - 2025/05/07 (水) 16:47:55 - おお

非特異が出た場合普通はマグネシウム濃度下げます。

PCRでのMgとMnの共存

削除/引用

No.12947-1 - 2025/05/07 (水) 15:24:51 - Ca

いつも参考にさせていただいております。

現在、訳あってTth酵素を用いた1stepのRT-qPCRを行おうとしています。
しかし、エンドポイントのPCR後の産物を電気泳動すると
非特異産物が発生していました。

プライマーの変更が望ましいと思いますが、
現状この変更が諸事情で行いにくいです。

Tthの逆転写にはMnが必須ですが、このMnのせいで非特異産物が
発生しやすくなっていると推測しておりますので、
ここにMgを添加することで非特異産物の発生を抑えられないかと
考えています。

実際にこのような手法を取ること等はありますでしょうか。
ご教示いただけますと幸いです。

全32件 ( 21 ～ 32 )　前 | 次　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

〔使い方〕

「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。