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(無題) 削除/引用 No.12945-16 - 2025/05/09 (金) 11:08:45 - おお で、質問からもしかしたらちょっと外れていっているかもしれないので（ただ考えに入れるべきパラメーターではありますが）、、、 その５０kDaぐらいに出るというサンプル、アクチン以外は検出されましたか？

(無題) 削除/引用 No.12945-15 - 2025/05/07 (水) 22:47:56 - G25 sodium azideが使えるかも。 Peroxidaseや電子伝達系の不可逆阻害剤ですが、これはazideがPOやシトクロムに配位する鉄イオンと錯体を作り触媒能を奪うためだと記憶します。 PO標識の二次抗体とは遊離のazideと共存させなければ問題ないので、ブロットをsodium azide処理した後、よく洗って遊離のazideを除けば良い。

(無題) 削除/引用 No.12945-14 - 2025/05/07 (水) 11:48:31 - 2 ヘモグロビンはその量が非常に多い場合（赤血球のライゼートなど）はhemeのペルオキシダーゼ様活性でHRPの化学発光法で反応することがありますが、SDS ~PAGE・western blottingではヘモグロビンは15KDaくらいですので質問の中の分子量とは違う様に思います。あと骨髄？由来の検体で、同様の理由で考えられるものは好中球のミエロペルオキシダーゼですがこれは50KDaくらいです。ただ好中球のライゼートのWestern blottingしたときにHemeに起因するようなシグナルが出たことはありません。 いずれにせよhemeprotein由来かどうかは、blottingした後で１レーンだけ切り離して１次抗体なしもしくは１次、２次抗体なしで反応させてシグナルが出るかどうか見てみれば容易にわかります。 もしHemeproteinに起因するならば、0.3%過酸化水素/ メタノールで15~20min程度、blotを洗えばhemeは壊れると思うので、blottingした後に、そうした処理を入れればHemeの偽陽性反応は消えると思います。ただ可能性は低いですが（特にモノクローナル抗を使用する体の場合）抗原性に影響を与えるリスクはありうるのでその点は一応留意しましょう。

(無題) 削除/引用 No.12945-13 - 2025/05/07 (水) 05:39:01 - あの 変な文字化けは、次が正しいです H₂O&#8322　　はH2お2 〜　　は　”から“ 0.5–2 mM　は　0.5から2mM &#8226などは　スペース

(無題) 削除/引用 No.12945-12 - 2025/05/07 (水) 05:27:29 - あの ありがとうございます。Chat GPTに聞いてみたら次が出ました: この問題は、ヘム鉄（Fe2+/Fe3+を含むポルフィリン構造）が持つ自己発光や抗体との非特異的結合、酸化ストレス誘導などが影響している可能性が高いです。 転写後にできる対策は以下のようなものがあります： ⸻ 【推奨する処理ステップ】 1.メンブレン上での過酸化水素（H₂O₂）処理 •転写後にメンブレンを0.01〜0.1%過酸化水素（H₂O₂）溶液で数分間洗浄します。 •→ ヘム鉄の酸化を促し、非特異的発光や結合を減らすことができます。 2.強めのブロッキング •いつもより高濃度（例：5% BSA（脱脂粉乳ではなく）や、10% BSA）でブロッキング時間を延長します（1〜2時間、場合によっては一晩）。 •ヘム構造体と抗体が直接結合するのを防ぎます。 3.キレート剤を使ったウォッシュ •転写後またはブロッキング時に**EDTA（エチレンジアミン四酢酸）**を0.5–2 mM添加すると、遊離している鉄イオンをキレート除去できます。 •特にメンブレンをPBS-T + 2 mM EDTAで洗浄すると効果的なことが多いです。 4.抗体希釈液への添加物 •抗体希釈液にもEDTAやBSAを含め、非特異的な結合をさらに抑えます。 ⸻ 【具体的な簡単プロトコル例】 転写後のメンブレン処理： 1.メンブレンをTBS（またはPBS）で軽く洗浄（5分×2回） 2.0.03% H₂O₂（過酸化水素水） in PBSで5分間インキュベート 3.TBS-Tで洗浄（5分×3回） 4.5% BSA in TBS-Tでブロッキング（2時間または一晩） 5.抗体インキュベーション（抗体希釈液にも1 mM EDTAを追加） ⸻ 【注意点】 •H₂O₂処理時間が長すぎるとターゲットタンパクも損傷するので、最初は**短め（3〜5分）**から試してください。 •ブロッキング剤は「脱脂粉乳」だと鉄イオンが入っている場合もあり、問題を悪化させることがあるので、BSA推奨です。 •EDTAは金属依存性の抗体（例：リン酸化抗体など）には影響することがあるので、使用には注意してください。

(無題) 削除/引用 No.12945-11 - 2025/05/07 (水) 04:12:28 - おお >鉄イオンを3+から2+、あるいは逆にすれば ちょっと確認しないといけないですが、電子の受け渡しを仲介しているならそれは効果があまりないのかも。

(無題) 削除/引用 No.12945-10 - 2025/05/07 (水) 01:20:15 - おお >[Re:8] あのさんは書きました : > 血液混入が多い時に現れるバンドは、ヘモグロビンのバンドということですね。　何かこのバンドをブロックする方法をご存知ですか？　鉄イオンを3+から2+、あるいは逆にすれば、エクストラバンドを消せるのでしょうか？ > 組織染色でendogenous peroxidasesを不活化するのには３％ぐらいの過酸化水素を使いますが、WBでやっている人いるのかなとか、、、EDTAとかどこかの時点でそこそこの濃度で使えば鉄イオン除けないかしら。

(無題) 削除/引用 No.12945-9 - 2025/05/06 (火) 20:55:08 - G25 >[Re:8] あのさんは書きました : > おおさん　ありがとうございます。 > > > “ヘム鉄がHRPのような反応をするということだった記憶があります。ルミノールの反応は警察が血液が付着してないか見るのに使われてますよね” > だとすると一次、二次抗体無しでも出るバックグラウンドですね。

(無題) 削除/引用 No.12945-8 - 2025/05/06 (火) 18:24:15 - あの おおさん　ありがとうございます。 “ヘム鉄がHRPのような反応をするということだった記憶があります。ルミノールの反応は警察が血液が付着してないか見るのに使われてますよね” 血液混入が多い時に現れるバンドは、ヘモグロビンのバンドということですね。　何かこのバンドをブロックする方法をご存知ですか？　鉄イオンを3+から2+、あるいは逆にすれば、エクストラバンドを消せるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12945-7 - 2025/05/06 (火) 13:52:57 - G25 念の為お聞きしますが、 一次抗体なしでは出ないバンドですか。 つまり二次抗体の交差反応(例えば内在性のIg)の可能性は排除できる？

(無題) 削除/引用 No.12945-6 - 2025/05/06 (火) 13:31:51 - おお >[Re:4] あのさんは書きました : > ちょっと訂正。血液の混在量が多い場合には、複数バンド、特に小さいサイズがでる印象があります ヘム鉄がHRPのような反応をするということだった記憶があります。ルミノールの反応は警察が血液が付着してないか見るのに使われてますよね。

(無題) 削除/引用 No.12945-5 - 2025/05/06 (火) 11:49:30 - 2 actinはアポットーシスの過程のどこかで限定分解されると思うのでもしそう言うことが起きてれば分解物として検出されるかもしれないです。だからactinはapoptosisの実験では内部標準には適切でないと昔習いました。 あと検体について教えてくだささい。骨細胞とは具体的にどういったものでしょうか。単に骨髄を取り出してそれを検体としたとか、あるいは骨を破砕して可溶性成分を抽出してとかでなくて、骨から色んな細胞を分離してと言うことでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12945-4 - 2025/05/06 (火) 11:04:05 - あの ちょっと訂正。血液の混在量が多い場合には、複数バンド、特に小さいサイズがでる印象があります

(無題) 削除/引用 No.12945-3 - 2025/05/06 (火) 11:02:51 - あの サンプルに血液が混在していると、複数バンドでるような印象もっています

(無題) 削除/引用 No.12945-2 - 2025/05/06 (火) 09:43:58 - おお https://www.cytoskeleton.com/actin-post-translational-modifications ユビキチンやSUMOなどの修飾ならそれぐらいシフトがありそうだけど、すべて修飾されているかというとちょっと疑問ではあります。

WBで検出されたactinBの分子量が42kDaでない理由 削除/引用 No.12945-1 - 2025/05/06 (火) 00:57:56 - Yuni Western Blottingでノーマライズ用にactinBを検出したのですが，データシートに書かれている42kDaで検出されず，約30kDaと約35kDa，約55kDaの位置で検出されます． 用いたタンパク質は，78週齢以上のB6マウス骨細胞から抽出したもので，抗体は，Cell signaling technology#4970と，Sigma-Aldrich #A5441の2種類を用いましたが，どちらも同様に検出されます． ただ，同じ方法で7週齢のB6マウス由来のactBについて検出したところ，30kDaと42kDaで検出されました． アポトーシスした細胞のactBは30-42kDa程度になるということは拝見しましたが，分子量が増加した理由等について，いまいち納得しきれません． actBの分子量が42kDa以外で検出される理由，および，加齢変化する理由について，何かご存じの方がいらっしゃいましたら，ご教授いただけますと幸いです．

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