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(無題) 削除/引用 No.12935-13 - 2025/05/04 (日) 02:00:58 - おお >[Re:12] CRISPRさんは書きました : > おお先生 > > スクリーニングの方法についてはそのようなやり方をしている同僚もいますね。 > 私は96-well plateから12-well plateまで増やすのが手間に感じないのと、ゲノムを抽出してPCRして制限酵素して電気泳動して トリプシン処理した一部は抽出せず、ボイルしてそのままPCRしてました｡細かいことですが。 私がやったのはメインにイントロン部分の編集でRNAレベルのメタボリズムを見てたので、WBは役に立ちませんでした｡ タンパクレベルでのKOの実験でなら、一応読む努力はすると思います。「WBで検出出来ない=タンパク質が発現してない」と言えるかという点で厳密には(色々ごたくを並べるレベルかもしれませんが）そうでもないと思う節がありますので。

(無題) 削除/引用 No.12935-12 - 2025/05/03 (土) 19:26:50 - CRISPR おお先生 スクリーニングの方法についてはそのようなやり方をしている同僚もいますね。 私は96-well plateから12-well plateまで増やすのが手間に感じないのと、ゲノムを抽出してPCRして制限酵素して電気泳動して、というのを各クローンごとに行うのが手間に感じてしまうので、WBでスクリーニングをしています。ただし抗体があればの話になります。なければゲノムを読むことにしています。 話は戻りますが、おお先生はKO細胞を作製する際にはゲノムもきちんとよむべきというスタンスを取られますでしょうか？ご意見聞かせていただけましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.12935-11 - 2025/05/02 (金) 21:02:26 - おお 効率にもよるし、配列にもよるのだろうけどCRISPRでキレる位置の極近傍あるいは切れる場所で制限酵素認識配列が有ればPCRして制限酵素処理してきれないクローンを選ぶというのもやれなくはない。 これなら96ウェルで増えてきたものをトリプシンで処理して24ウェルとかにまき変えた時に、トリプシン処理した細胞懸濁液の一部をPCRに回してPCR産物を制限処理すればスクリーニングできる。 制限酵素を使うので、INDELが入っていても見つけられないものもあるだろうけど、そこは割り切るかどうかの判断だと思う。

(無題) 削除/引用 No.12935-10 - 2025/05/02 (金) 16:19:37 - CRISPR AA先生 ありがとうございます。 やはりゲノムも読むべきというご意見でした。 私はいつもGFP, Cas9, gRNAが共発現するplasmid DNAをtranfectionして2日後に、96-well plateへシングルセルソーティングしています。 その後、30個ほどシングルコロニーを得たら、12-well plateに移植し、コンフレントになったらそのうちの90%をlysateにしてWBで確認。10%を同じwell内で継続培養します。WBは翌日には結果が出ているため、そこでKO体を数個に絞っています。 AA様はシークエンシングでスクリーニングし、その後にWBとのことですが、シークエンシングはdirect sequencingをしたのちのTIDE解析でしょうか？その時点でPCR産物のクローニングとSanger seqは現実的ではないかなと思っていますが、ご意見聞かせていただけましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.12935-9 - 2025/05/02 (金) 13:12:22 - AA WBかシーケンスか、二者択一でどっちかだけで判断ということはないんじゃないでしょうか？ 最終的にWBで発現が落ちていればKO株ということになると思いますが、WB行く前にゲノムも読んで調べる株を絞り込まないと培地も抗体ももったいない気がします。ゲノムは極論1細胞あれば調べられますが、WBに必要な細胞数は全然違うと思いますし。 ただ、例えば3nのindelでもWBで発現消失しているということはよくありますので、ゲノム読んだ時点で諦めない方が良いこともあるとは思います。

(無題) 削除/引用 No.12935-8 - 2025/05/02 (金) 09:57:04 - CRISPR 皆様 大変多くのコメントをいただきまして、ありがとうございました。 従来のクローニングしてSangerを行う方法が無難ということがわかり、安心（？）いたしました。 アンプリコンシークエンシングというのが漠然としてあるのかと思いましたが、リードが短いためにNGSに向かないとのこと、納得できました。ありがとうございます。 一点、大変興味あるコメントをいただきました。 ゲノムの配列は読まず、ウエスタンレベルで検出不可のものをKOと定義する、とのことでした。 実はこれまでにもそのような判断をとってまいりましたが、ラボの同僚が別の遺伝子のKOを作製する際に、ゲノムレベルでの検証を行なっていたため、そうする必要があるのか、一般的なご意見をさらに聞かせていただけましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.12935-7 - 2025/04/30 (水) 11:31:37 - 独り言 そもそもの質問が、CRISPR　KO細胞の場合、シークエンスを確定することが必要なのかという問いであれば、ウチはやってません。 ウエスタンブロットでタンパク質レベルで検出できなければKOとして使用しています。個人的な経験では、論文ではウエスタンの結果しか出してませんが、reviewerにシークエンスを確かめろと言われたこともないです。 もちろん、KOしただけだとオフターゲットなどがあるので、KO細胞に目的遺伝子を外来的に発現させたレスキューがより重要な証明方法になると思います。

(無題) 削除/引用 No.12935-6 - 2025/04/30 (水) 10:35:51 - NGS PCR産物を末端リン酸化するか、プライマーに制限酵素サイトを導入しておくかしてライゲーションしてコンカテマー（？）を作っておいて、それをクローニングしてNGSとか？

(無題) 削除/引用 No.12935-5 - 2025/04/30 (水) 10:15:39 - AA TIDEとかICEのようなサンガーの波形ファイルベースでの解析はバルクの解析では一般的ですが、精密に解析を求められた場合は不適なような気がします。 すでにご指摘ある通り、複数の異なる改変があった場合に配列決定ができないからです。 なので本当に正確に配列決定したいのであれば、やはり古典的な方法論にせざるを得ないかと思います。 カリオタイプが複雑とはいえ、(シングルクローンにしてある前提では)基本的には数種類程度の有限の組み合わせしかないはずですので、調べればそれほど苦も無く同定できると思います。 NGSだとロングリードじゃないと特定できなそうでむしろ大変そうな気がします。

(無題) 削除/引用 No.12935-4 - 2025/04/29 (火) 02:52:57 - おお 私もちょっとTIDEで完全にわかるかという点ではちょっと懐疑的です。例えば両方のアレルにインサートがある場合その部分ではどちらのアレルに振り分けていいか結論が出ないので。その他にも考えたら完璧でなさそうという例が挙げれそうですが机上の空論になってしまうかもしれませんので置いときますが、TIDE制作者とかに問い合わせてもいいかもしれません。論文でDiscussionしてるかな？ 配列を決める手としては、クローンにしてからの他にnext-generation sequencing (NGS)を使うという話は確かに聞きます。

(無題) 削除/引用 No.12935-3 - 2025/04/28 (月) 19:34:05 - CRISPR maru様 ありがとうございます。 実は私もTIDE解析はしているのですが、±10塩基のindelなら解読可能ですが、そうでないならわからないままではないかと思いまして、sangerで読むべきか、けどそれだと手間がすごいし・・と思ってトピックを立てさせていただきました。 maru様は、TIDE解析だけで十分信用できそうでしょうか？レビュアーにクレームが来ないかそこは心配ではあります。 例えばTIDE解析のリンクで、Load example dataをクリックすると例の結果が出てきますが、全ての数字を足しても93%ほどです。7%は不明（黒いバー）になるのかと思います。それでもいいのでしょうか？ ちゃんと読む必要はないのかなというのが質問でした。 わかりずらく大変申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.12935-2 - 2025/04/28 (月) 14:04:55 - maru うちではTide（http://tide.nki.nl）を利用しています。 KOのシーケンスデータから、Indelの種類と頻度を推定してくれます。 Togo TVに使い方の説明動画があります↓ TIDE を使ってゲノム編集で生じたIndelを解析する https://togotv.dbcls.jp/en/20210423.html

ゲノム編集の調査方法について 削除/引用 No.12935-1 - 2025/04/27 (日) 20:05:07 - CRISPR よろしくお願いします。 私は293T細胞においてCRISPR-Cas9によるとある遺伝子のノックアウトを作製しています。 ウエスタンブロットによるスクリーニングの結果、いくつかKOが採れてきましたが、indel変異を詳細に調べる必要がでてきました。 293Tはdiploid細胞ではないことは承知です。 また、ゲノム編集領域を挟む形でゲノムPCRを行い、direct sequencingにより波形がぐちゃぐちゃになっていることは確認しています。 このPCR産物をTAベクター等にクローニングして、sequencingをすれば正確なindel変異が読めるかとは思いますが、2025年現在、そのような目的のために上記の（古典的な？）方法は第一選択になりますでしょうか？ もしかしたらadvancedな技術を使って、スマートに結果がわからないものかなと思った次第です（NGSなど？）。 ご教示いただけましたら幸いです。

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