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(無題) 削除/引用 No.12914-17 - 2025/04/14 (月) 14:08:51 - G25 ちなみに底から一段注入するごとに凍らせながら重層して（前段が凍っているので界面が乱れない）、使用前に冷蔵庫でゆっくり融解することでリニアな濃度勾配を作るという方法があります。 原著はたぶんこれだったかと、 https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0003269783907558

(無題) 削除/引用 No.12914-16 - 2025/04/14 (月) 12:08:39 - toto > 0% (サンプル)、1%、2%、5%、10%、15%としていいます。 なるほど、かなり狭いですね。mixerでリニアな勾配を作るのではなく、このように各濃度の溶液を載せてステップワイズに行う場合には、普通は、サンプル以外を重層してから一晩4度で置いて各界面でショ糖を拡散させて、濃度勾配がカクカクではなく、なるべく勾配になるようにすると思います。 されておられるのは沈降速度の差で分離することですね？それであれば、あまり長い時間やると全部落ちてしまいます。比重で浮かせる目的であれば長い時間をかけると分離は基本良くなるだけですが。 沈降速度係数の違いで分離するのならば、グリセロールグラジエントの方が狭い範囲での分離は良くなります。ショ糖よりも粘性が高いので乱れにくいですし。

(無題) 削除/引用 No.12914-15 - 2025/04/14 (月) 10:26:23 - う ＞topからbottomにかけて、0% (サンプル)、1%、2%、5%、10%、15% これなら、p!000のチップの先を切って、ピペットマンのピぺっティングで積み上げていけると思うので、 その後とりあえず、p!000のチップの先を切って上から少しずつ吸い上げて重さ（比重）を測ってみるのはどうですか。

(無題) 削除/引用 No.12914-14 - 2025/04/13 (日) 11:29:51 - qq ショ糖密度勾配遠心では、勾配の自己形成は期待されませんから、遠心時間は成分の収束を高めるようにしか働かないでしょう。 ショ糖濃度が極めて薄いのですね。 5%ショ糖辺りに分離したいのだとすると、比重1.02程度のようですからタンパク質含量の低い成分を分離したいのでしょうかね。 リポタンパクのような分画を見ると良いかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.12914-12 - 2025/04/12 (土) 17:47:23 - あなん 追加でお伺いします。 密度勾配の形成の成否は遠心時間は関係ありますでしょうか？ 例えば短いと相にならないなど。

(無題) 削除/引用 No.12914-11 - 2025/04/12 (土) 17:46:22 - あなん totoさん、ありがとうございます。 ＞ショ糖密度勾配遠心では低分子の色素は長時間の遠心中に拡散して全体に広がるのが普通です。蛍光標識した抗体でも載せれば別ですが、もったいなさすぎですし。色素の拡散と、ポジコンがうまく行ってないのは関係なさそう。 →とすると、蛍光色素は遠心前の「重層がうまくいっている確認」にしか使えなそうですね。最後は密度勾配ができていようとできていなかろうと混ざってしまうということですね。 ＞10-40％程度のグラジエント（重層にしても）でしょうか？ひっくり返さない限りは失敗することはまずない手法ですが、ミスるとすると、遠心後に回収するときに、下から針刺して取ったのならば、そのときに空気が入って乱れたとか（それでもたいした乱れにはなりませんが）、くらいしか思いつきません。単純に分子の沈降速度に応じた分離をするので、とくにポジコンも要らないはずですが、各フラクションを電気泳動すれば、分離が起きてるかどうかはわかるはずです。どちらかというと、そのポジコンを疑ってもいいかもしれません。 →先述しましたが、勾配は一般的なものに比べて緩やかなようです。各フラクションを分析しましたが、少なくともポジコンは想定する結果とはなりませんでした。

(無題) 削除/引用 No.12914-10 - 2025/04/12 (土) 17:42:40 - あなん ＞これは正しい方法、正しい見立てなんでしょうか色素なんて容易に拡散するでしょう。放っておいても均一に分散しそうだが そのような気は正直しています。 なのでポジコンを置きました。ですが、うまくいかなかったので本投稿になりました。

(無題) 削除/引用 No.12914-9 - 2025/04/12 (土) 17:41:23 - あなん 大変恐縮ですがポジコンは明言できません。すみません。

(無題) 削除/引用 No.12914-8 - 2025/04/12 (土) 17:40:21 - あなん qqさん、ありがとうございます ＞蛍光付きのポリスチレンビーズなんかじゃないよね？ もちろん遠心で落ちては意味がないので、水溶性の蛍光色素を使っています。 蛍光色素由来の沈殿がないことも確認済みです。 ＞最後のポジコンには何を使い、濃度勾配のどこの層に入れたのでしょうか？ ＞その時のトップとボトムのショ糖濃度は、いくらだったのでしょう？ topからbottomにかけて、0% (サンプル)、1%、2%、5%、10%、15%としていいます。 一般的な勾配より緩やか (溶液間の差が少ない) ので難易度は上がるようですが、論文報告を参照しているので止む無しです。

(無題) 削除/引用 No.12914-7 - 2025/04/12 (土) 17:35:36 - あなん そもさん、ありがとうございます。 ＞遠心機の加速・減速の設定はどうでしょうか。 加速・減速は最遅設定です。

(無題) 削除/引用 No.12914-6 - 2025/04/11 (金) 14:11:24 - toto ショ糖密度勾配遠心では低分子の色素は長時間の遠心中に拡散して全体に広がるのが普通です。蛍光標識した抗体でも載せれば別ですが、もったいなさすぎですし。色素の拡散と、ポジコンがうまく行ってないのは関係なさそう。 10-40％程度のグラジエント（重層にしても）でしょうか？ひっくり返さない限りは失敗することはまずない手法ですが、ミスるとすると、遠心後に回収するときに、下から針刺して取ったのならば、そのときに空気が入って乱れたとか（それでもたいした乱れにはなりませんが）、くらいしか思いつきません。単純に分子の沈降速度に応じた分離をするので、とくにポジコンも要らないはずですが、各フラクションを電気泳動すれば、分離が起きてるかどうかはわかるはずです。どちらかというと、そのポジコンを疑ってもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12914-5 - 2025/04/11 (金) 12:56:05 - G25 > しかし、超遠心後に蛍光色素は混ざってしまっていたことから、密度勾配が崩れてしまっていると判断しました。 これは正しい方法、正しい見立てなんでしょうか色素なんて容易に拡散するでしょう。放っておいても均一に分散しそうだが

(無題) 削除/引用 No.12914-4 - 2025/04/11 (金) 12:32:09 - 774R 密度は微量天秤があれば大雑把に測定できますよ。

(無題) 削除/引用 No.12914-3 - 2025/04/11 (金) 10:50:23 - qq 「蛍光色素をつけた各種濃度のショ糖溶液」の蛍光色素には何を使ったのでしょうか？ 蛍光付きのポリスチレンビーズなんかじゃないよね？ 入れた蛍光色素が遠心分離された可能性も考えてもいいのかな？ 蛍光色素は、一つの層にだけ入れてみたらどうでしょうか？ 最後のポジコンには何を使い、濃度勾配のどこの層に入れたのでしょうか？ その時のトップとボトムのショ糖濃度は、いくらだったのでしょう？

(無題) 削除/引用 No.12914-2 - 2025/04/11 (金) 09:01:17 - そも 遠心機の加速・減速の設定はどうでしょうか。 急激に遠心強度が変わると中で溶液が混ざってしまうため、密度勾配を使うときは加速・減速がゆっくりになるように設定するのが一般的です。この情報はあまり論文に記載はしないと思うので、トレースする際に抜け落ちているのかもしれません。

ショ糖を用いた密度勾配遠心のコツについて 削除/引用 No.12914-1 - 2025/04/11 (金) 00:05:56 - あなん お世話になります。 ショ糖を用いた密度勾配遠心についてご教示いただければ幸いです。 この手法について完全な初心者です。 そこで本番を始める前に、まずは密度勾配が遠心後も適切に維持できているか検証する意味で、蛍光色素をつけた各種濃度のショ糖溶液を重層し、スイングローターにて超遠心しました。 しかし、超遠心後に蛍光色素は混ざってしまっていたことから、密度勾配が崩れてしまっていると判断しました。 この検討の最終的なゴールは、密度勾配遠心によりサンプルを分画・分析した論文報告をトレースすることです。 そのため、勾配条件や遠心時間、温度、gは揃えています。 重層はネットで調べ、そこに沈めたニードルでゆっくり実施しました。 遠心前は（多少は混ざってしまいますが）概ね層が維持されていることは確認済みです。 念の為、密度勾配遠心された際の挙動が論文で既知のポジコンを試しましたが、完全に沈んでしまっており失敗しています。（密度勾配遠心が成功していれば、中間層に分画されるはずなので） 何が不適なのかまったく見当もつかず、ご教示いただけると大変助かります。

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