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(無題) 削除/引用 No.12913-7 - 2025/04/16 (水) 02:51:37 - おお トランスファーバッファーはメタノールが入っていると思うので、ゲルが少し縮んで蛋白もある意味固定されるので比較的拡散は抑えられると思います。しかしながらゲルから蛋白が出にくくなったりする可能性はあると思います。 ただ十分にトランスファーバッファーに置換してからトランスファーするプロトコールもあるので、大抵の場合は固定されてトランスファーされないと心配する必要もないのかもしれません。ある程度の量があると沈着しそうではありますけど。

(無題) 削除/引用 No.12913-6 - 2025/04/14 (月) 13:40:23 - 大学院生 皆様 ご意見ありがとうございます。 774R様のコメントにあるようにトランスファーバッファーに漬けて4℃でオーバーナイト(16時間ほど)で保存してみたところ、その後のWBでは問題なく目的のタンパクを検出できましたので私が見ようとしているタンパクに関してはこの方法で保存しても問題ないという結果になりました。 別のタンパクを見る際には影響出るかもしれませんので、どうしても時間を空ける必要がある場合のみの応急手段ということで頭に入れておきます。

(無題) 削除/引用 No.12913-5 - 2025/04/11 (金) 02:57:53 - おお >[Re:4] 2さんは書きました : > > MMPのゲル内での活性染色はSDS-PAGE後にSDSで変性した酵素をrenaturationさせるためTriton X含有のbufferに浸けて一晩くらいインキュベーションするステップがありますが、結果的には活性のバンドは結構シャープですので、タンパク質はそんなに簡単に抜けたりゲル内に拡散したりしないようです。 基質とのアフィニティーが関与している可能性はありませんか？

(無題) 削除/引用 No.12913-4 - 2025/04/10 (木) 23:48:03 - 2 急用が入ったり、段取りが悪くてすぐに次に進めないときは泳動槽からガラス板を取り出して、とりあえずガラス板ごと（ガラス板開けてゲルを取り出すことなしにそのまま）４℃に入れてます。少なくとも当日中(だいたい10hrs以内くらい)ならば、拡散などの問題は見られず普通に綺麗なデータが得られてます。やったことないですが感じとしては一晩とかでもたぶんいけそうな気がします。 MMPのゲル内での活性染色はSDS-PAGE後にSDSで変性した酵素をrenaturationさせるためTriton X含有のbufferに浸けて一晩くらいインキュベーションするステップがありますが、結果的には活性のバンドは結構シャープですので、タンパク質はそんなに簡単に抜けたりゲル内に拡散したりしないようです。

(無題) 削除/引用 No.12913-3 - 2025/04/10 (木) 18:08:19 - おお 指摘があるようにCBB染色で有れば、固定用の液(酢酸5％、メタノール30％ぐらいだったかな)につけて保存する。 wbの場合トランスファーまで終わらせる。どうしてもと言うときはタイマーをかけて止まるようにする｡トランスファーが終わった後はすぐに取り出さなくてもあまり問題がないと個人的には思う。 泳動が終わったゲルをそのまま保存する事は絶対にしない｡拡散によってバンドが見づらくなる可能性があるので｡そもそも電圧をかけることでどんどん+局側にタンパクが流れるほど自由度があるので、ほっておけば拡散してもおかしくない。

(無題) 削除/引用 No.12913-2 - 2025/04/10 (木) 16:20:07 - 774R 時間を空けてCBB染色 　ゲル内にタンパク質を固定したほうが望ましいので固定液に入れる。もしくは、染色液に入れっぱなしでも問題ない。後で脱色すればよいだけ。 時間を空けて転写 　時間が経つとタンパク質が拡散してしまいバンドがスメアーになる可能性があるので、基本的にこの状態で長時間は置かない。せいぜい数時間までにしてる。 どうしても長期保存がしたいなら、タンパク質がゲル内を泳動出来る状態をキープする必要がある。トランスファーバッファーに漬けるとかですかね。拡散を防ぐために冷蔵保存。 厳密には直ちにトランスファーする場合と比べ、ゲル内のバッファー組成が変わるので、結果に違いが出る可能性があるが、それが問題にならない実験ならまあよいだろうと思う。

SDS-PAGE後のゲルの保存 削除/引用 No.12913-1 - 2025/04/10 (木) 16:12:24 - 大学院生 みなさん、SDS-PAGE後に時間を空けてCBB染色や転写を行いたい場合は泳動後のゲルをどのように保存されていますか？ 我々のラボだと日を空けたりする場合はゲルをカットしてタッパーにRunning bufferと一緒に入れて4℃で保存、数時間空ける場合は泳動槽ごと冷蔵庫に入れているのですが問題なさそうですかね。 うちではこうしている、そのやり方は問題があるなどご意見いただければ嬉しいです。よろしくお願いします。

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