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(無題) 削除/引用 No.1291-8 - 2014/01/17 (金) 18:21:30 - ta 他の編集法は検討しているのでしょうか

(無題) 削除/引用 No.1291-7 - 2014/01/17 (金) 17:56:15 - tuideni http://www.sigmaaldrich.com/life-science/zinc-finger-nuclease-technology/learning-center/zfn-faqs.html What are the advantages to delivering ZFNs to cells in mRNA form? There are many advantages to using a ZFN mRNA transcript. We have found the following benefits in a number of tested cell types: 1. Eliminates the risk of random genome integration of the expression plasmid DNA. 2. Lower cytotoxicity (RNA vs. DNA). 3. Higher efficiency in most tested cases. 4. Expanded range of cell types that zinc finger nucleases can be applied to because some cell types do not tolerate input DNA. 5. Eliminates the need to use different promoters for ZFN expression in certain cell types. RNA is universal to all cell types. 6. Eliminates the necessity of nuclear delivery, allowing a larger range of transfection reagents to be usable in delivery. Expression vectors have to enter the nucleus to be transcribed, while mRNA gets translated in the cytoplasm. 7. Lower off-target events by exposing cells to ZFNs for a shorter time (mRNA has a shorter half life than DNA).

(無題) 削除/引用 No.1291-5 - 2013/01/07 (月) 23:22:29 - DEC 細胞株はKhES-1およびEB5、薬剤選択ありでGFPレポーターノックインを樹立するのに使いました。 ラボの他の研究員が使ったのも含めて4、5セット試しましたが、基本mRNA、plasmidどちらでも問題なく組換株が取得できました。RNAとDNAなので直接的な比較は難しいですが、ノックイン効率にそれほど大きな差もありませんでした。実際に使用する株はmRNAを使った株を優先しています。 おお様が書かれているようにSigmaのZFNならin vitro transcription用のプロモーターがplasmidに乗っていますので、mMESSAGE mMACHINEのようなkitを使って自前で合成も可能です。ラボ内でin vitro transcriptonの系が動いていないなら、Kitの値段と手間を考えると10万出してmRNAを買ったほうが良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1291-4 - 2013/01/02 (水) 10:27:22 - おお ところでmRNAはいざとなったらプラスミドから作れるんじゃないですか。。。そのプラスミドがmRNA作成用に作られているか確認してみてはどうでしょうか。T7RNApolとかで作るんだと思いますが、polyAがつかないのでAのextension(polyAシグナルじゃなくって)がプラスミドにコードされているはず。

(無題) 削除/引用 No.1291-3 - 2012/12/29 (土) 03:38:54 - おお http://www.sigmaaldrich.com/life-science/zinc-finger-nuclease-technology/learning-center/zfn-faqs.html What is the best way to deliver the ZFN and the repair template into the cells? Repair templates are typically co-delivered into the cell as circular plasmid DNA. The ZFN itself can be delivered as a plasmid, or as an mRNA transcript. We have found both plasmid and mRNA to be effective depending on cell type and, therefore, provide customers with ZFNs in both plasmid and mRNA form to test in their own cell lines. Regardless of form, we have found that the use of nucleofection or electroporation generally produce the highest cleavage efficiencies. Due to this increase in efficiency, we recommend using an electroporation or nucleofection delivery method if possible. Lipid-based transfection also works in many cases, but may result in lower efficiencies. シグマのFAQにはどちらでも基本的に可能とかかれていますが、、、

(無題) 削除/引用 No.1291-2 - 2012/12/29 (土) 02:06:56 - biochem プラスミドよりもMRNAのトランスふぇくしょんが推奨されてるはずです

ZFNのノックアウトReady-to-made kitを利用した方に質問です 削除/引用 No.1291-1 - 2012/12/28 (金) 11:39:02 - このサイトいいね ZFNのノックアウトReady-to-made kitを利用した方に質問です。 mRNA無しと有りとでは10万円くらい差がありますが，実際，mRNAは必要でしょうか？（つまりPlasmidだけでも目的の遺伝子をノックアウトできたでしょうか？） もちろん細胞によるだろうと思いますので，細胞株名とともに使った感想を教えてください。 よろしくお願いいたします。

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