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(無題) 削除/引用 No.12909-19 - 2025/04/10 (木) 10:43:23 - おお >[Re:18] うさんは書きました : > 共通の領域が（糖鎖などで）修飾されていて、モノクロごとに認識できる修飾形態が違うとか。 ありがとうございました。アイソフォームによって共通のエピトープ部位の修飾のされ方が異なるというのはあり得る説明ですね。そこまで詳細なデーターがあるのかということもありますが、やはり一度調べてみるべきかもしれません（なんとなく可能性としては思ってはいたのですが）。Top downのMSのデーターがあればわかりやすいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.12909-18 - 2025/04/10 (木) 10:37:35 - う 共通の領域が（糖鎖などで）修飾されていて、モノクロごとに認識できる修飾形態が違うとか。

(無題) 削除/引用 No.12909-17 - 2025/04/10 (木) 03:55:07 - おお >[Re:16] いそふぉーむさんは書きました : > >ポリクロであっても抗体作成時の抗原が共通した部分であれば同じ議論になるかと思いますが > > そこらへんの情報が全然提示されてないから想像で補完して書いてるんですけどね。 > > おおさんの調べてるタンパク、仮にアイソフォームAとBとして、AとBはN末は共通、C末側の半分は違うとして、ポリクロ抗体がアイソフォームA全長を元に作られたもので、AのN末とAのC末の（どこかは知らんけど）複数個所をを認識するものの場合、これを使ってBを検出しようとしたら検出感度下がりませんか？BはN末側は抗体に認識されるから検出自体は出来るけど、C末側は認識されないんで。 > > >で結局何が起こってたのですか？ > 上に書いたようなことです。N末とC末が逆だけど。抗体はC末Specificだと聞いていたのが、データシート観たらほぼ全長を使って作られてました。メーカーに聞いたけど、エピトープマッピングは行ってないとのことでした。 > > なんか書いてんの馬鹿らしくなっちゃったな。以上です。 「共通する配列で作った抗体でも、」と書きましたが、、、すなわちエピトープはどちらのアイソフォームにも存在する事が分かっています。モノクロでエピトープ部位も明らかです。

(無題) 削除/引用 No.12909-16 - 2025/04/10 (木) 02:58:55 - いそふぉーむ >ポリクロであっても抗体作成時の抗原が共通した部分であれば同じ議論になるかと思いますが そこらへんの情報が全然提示されてないから想像で補完して書いてるんですけどね。 おおさんの調べてるタンパク、仮にアイソフォームAとBとして、AとBはN末は共通、C末側の半分は違うとして、ポリクロ抗体がアイソフォームA全長を元に作られたもので、AのN末とAのC末の（どこかは知らんけど）複数個所をを認識するものの場合、これを使ってBを検出しようとしたら検出感度下がりませんか？BはN末側は抗体に認識されるから検出自体は出来るけど、C末側は認識されないんで。 >で結局何が起こってたのですか？ 上に書いたようなことです。N末とC末が逆だけど。抗体はC末Specificだと聞いていたのが、データシート観たらほぼ全長を使って作られてました。メーカーに聞いたけど、エピトープマッピングは行ってないとのことでした。 なんか書いてんの馬鹿らしくなっちゃったな。以上です。

(無題) 削除/引用 No.12909-14 - 2025/04/09 (水) 14:24:28 - おお >[Re:8] egeriaさんは書きました : > https://www.nature.com/articles/s41586-024-07975-z > 最近出ていたNatureのMatters arisingです。 > > この論文のFig. 1cで、同じサンプルをウェスタンで調べたとき、2つのバンドのシグナル比がSigmaの抗体とAbcamの抗体で全く違うということが述べられています（著者によると下のバンドが切断産物だそうです）。エピトープが抗体間で共通しているかどうかはわかりませんが、似ている話だと思います。 > 具体的な例でリファレンスとして引けるものがあるのは助かります。詳細を見てみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12909-13 - 2025/04/09 (水) 14:20:21 - おお >[Re:11] 教員さんは書きました : > もし的外れだったらすみません。 > �@アイソフォームごとに発現制御機構が異なる（制御する転写因子が異なる） > �Aスプライシングアイソフォームの関係で、片方が増えれば片方が減る > などのシンプルな理由とは違うのでしょうか。 Isoformスペシフィックな抗体がありますので、変化はそれで追っています。その変化がわかった状態でPAN抗体のバンドパターンがIsoformスペシフィックな抗体から予想されるパターンにならないという事です。

(無題) 削除/引用 No.12909-12 - 2025/04/09 (水) 14:13:09 - おお >[Re:10] いそふぉーむさんは書きました : > 使ってる抗体はモノクロですかポリクロですか？ モノクロですね。ポリクロであっても抗体作成時の抗原が共通した部分であれば同じ議論になるかと思いますが > > 私、研究してるタンパクが同じように複数アイソフォームを持つのですが、元々はポリクロ抗体で検出してました。これを、発現ベクターを作って293細胞に作らせた時の検出を、その抗体とC'末につけたHis-tagに対する抗体（C末specificなやつ）の両方で試したことがあります。そうすると一つのアイソフォームがポリクロ抗体でだとバンドが薄いのが、His抗体だと非常に濃いバンド（といっても、同様に発現させた別アイソフォームと似たような濃さ）になったことがありました。そこで初めて、同僚が教えてくれたポリクロ抗体の情報とデータシートに書いてある情報が違うことに気付いたことがあります。、 で結局何が起こってたのですか？

(無題) 削除/引用 No.12909-11 - 2025/04/09 (水) 09:52:37 - 教員 もし的外れだったらすみません。 �@アイソフォームごとに発現制御機構が異なる（制御する転写因子が異なる） �Aスプライシングアイソフォームの関係で、片方が増えれば片方が減る などのシンプルな理由とは違うのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12909-10 - 2025/04/09 (水) 02:22:37 - いそふぉーむ 使ってる抗体はモノクロですかポリクロですか？ 私、研究してるタンパクが同じように複数アイソフォームを持つのですが、元々はポリクロ抗体で検出してました。これを、発現ベクターを作って293細胞に作らせた時の検出を、その抗体とC'末につけたHis-tagに対する抗体（C末specificなやつ）の両方で試したことがあります。そうすると一つのアイソフォームがポリクロ抗体でだとバンドが薄いのが、His抗体だと非常に濃いバンド（といっても、同様に発現させた別アイソフォームと似たような濃さ）になったことがありました。そこで初めて、同僚が教えてくれたポリクロ抗体の情報とデータシートに書いてある情報が違うことに気付いたことがあります。、

(無題) 削除/引用 No.12909-9 - 2025/04/08 (火) 21:54:41 - 774R 経験上、抗体の反応性は様々な原因で変化します。 ・メンブレンへの吸着の具合。 ・分子内相互作用によるエピトープのマスク。 ・エピトープの部位によって抗原性が失われる理由が異なる。 アイソフォームによって上記の挙動が違えばWBの反応も変わります。 実体験としては、HA-tagを付加した２つのアイソフォームに対し、同じエピトープを認識する抗体と抗HA抗体の反応性をXY軸にプロットしたところ、アイソフォーム間で違いがありました。具体的な原因は特定できていませんが。

(無題) 削除/引用 No.12909-8 - 2025/04/08 (火) 17:23:59 - egeria https://www.nature.com/articles/s41586-024-07975-z 最近出ていたNatureのMatters arisingです。 この論文のFig. 1cで、同じサンプルをウェスタンで調べたとき、2つのバンドのシグナル比がSigmaの抗体とAbcamの抗体で全く違うということが述べられています（著者によると下のバンドが切断産物だそうです）。エピトープが抗体間で共通しているかどうかはわかりませんが、似ている話だと思います。 なぜそうなるかという具体的な説明までは書かれてないみたいですね。

(無題) 削除/引用 No.12909-7 - 2025/04/08 (火) 14:29:38 - おお 書き方が悪かったのかもしれませんが分子量（泳動される位置）に関しては特に疑問を持っていません。アイソフォームA、Bがあってそれら両方を認識できる抗体があった場合、同じ量のアイソフォームを同一メンブレンでWBしてシグナル強度がちがった場合何がしかの具体的な説明ができるか、具体例があるのかという感じのことを聞きたかったのです。

(無題) 削除/引用 No.12909-6 - 2025/04/08 (火) 13:05:08 - 2 アミノ酸組成は膜への移行効率や膜への結合性と関係あると思いますので、二つのアイソフォームの本来の存在量が必ずしも膜上でのそれぞれの存在量に反映していない可能性は十分あると思われます。アイソフォームではありませんが、タンパク質を転写した後の膜と普通に泳動した後にゲルをそれぞれCBB染色したものを注意深く比べると必ずしも完全一致していない（ゲル染色上では多いタンパク質が膜上の染色ではあまり目立たない、またはその逆。）ことは時々あります。 SDS-PAGEの結果は本来の分子量を比較的正しく反映することが多いというだけで、その技術的な簡便さから汎用されているものの、あくまで見かけの分子量なので、SDSとの結合の状態やその量、アミノ酸組成の偏り、分子内disulfideの開裂の有無などで計算上の理論値と異なる易動度を示すことはたまにあります。

(無題) 削除/引用 No.12909-5 - 2025/04/08 (火) 09:16:41 - 教員 本当の分子量より30kDa くらい大きいところにバンドが出るのは経験したことがあります。含まれるアミノ酸のチャージなどによって割とよくあることのようです。片方のアイソフォームでこういったことに影響を与えるアミノ酸やアミノ酸のクラスターが有る（無い）場合、泳動度が変わる可能性があると思います。

(無題) 削除/引用 No.12909-4 - 2025/04/08 (火) 01:57:39 - おお アイソフォームがWBでサイズの違いで認識できています。PANではそのサイズの分布が２種類で比べたとき違うということ。またアイソフォームスペシフィックな抗体である処理をした検体では変化があるのに、PANではそれが反映されているように見えないこと。 個人的にはそういうことがあっても不思議ではないと思っているのですが、それでは具体性がなさすぎて人を説得するにはあまりにも漠然としているということで質問を立ち上げました。

(無題) 削除/引用 No.12909-2 - 2025/04/07 (月) 13:51:15 - う ＞少し泳動パターンが違います。 どう違うのか書かないと想像できません。

アイソフォームと抗体の反応性 削除/引用 No.12909-1 - 2025/04/07 (月) 10:22:01 - おお スプライシングアイソフォームが存在するタンパク質で、アイソフォームがWBでサイズの違いにより認識できるものを見てます。 PANの抗体（スプライシングアイソフォームの共通する部分に対する抗体）を二種類使っていますが少し泳動パターンが違います。KOを使うとどちらともバンドは検出されませんので、ノンスペが混じっていることは否定的です。 共通する配列で作った抗体でも、アイソフォームによって検出感度が違ったりとかあったら話としてとりあえずは落ち着くのですが、そういう感じのことに関してなにか知見がございましたら教えてほしいと思いました。 たとえばアイソフォームの特異的配列がWBの膜の結合の仕方に影響して、アイソフォーム同士同じ量でもエピトープの露出度が違ったりして検出感度に影響を与えるとか。

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