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(無題) 削除/引用 No.12908-9 - 2025/04/06 (日) 09:50:34 - おお >[Re:7] G25さんは書きました : > https://bmcbiotechnol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1472-6750-5-19 > 勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.12908-8 - 2025/04/05 (土) 18:07:41 - G25 BL21の派生系統で、プラスミドプレパレーション用じゃなくタンパク質発現用の宿主(なのでrecAやヌクレアーゼの欠損などを持たない) なんだけど C41とC43というのがあります。これは通常の宿主で発現させると致死になるようなプラスミドでも死ににくいというもの。このような宿主を使ってみるとか。

(無題) 削除/引用 No.12908-7 - 2025/04/05 (土) 17:28:49 - G25 https://bmcbiotechnol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1472-6750-5-19

(無題) 削除/引用 No.12908-6 - 2025/04/05 (土) 08:22:15 - サクラ 並行してたくさんの遺伝子を同じベクターにクローニングするような仕事をしたことがあって、ATリッチな酵母の遺伝子なんかだと哺乳類cDNAより歩留まりが悪かったので、大腸菌の中でプロモーター活性を持ちうる配列って結構ゆるいのだと思っています。

(無題) 削除/引用 No.12908-5 - 2025/04/05 (土) 08:07:54 - おお >[Re:4] G25さんは書きました : > 真核生物のプロモーターでも、下流にGFPなんかが入っているとコロニーが光ったりする CMVプロモーターからというエビデンスみたいなのがあるんでしょうかね。詳しく知りたいと思いました。プラスミドないにはアンプなどのプロモーターもありますし、そこからターミネーターをスルーしたごく一部のmRNAが発現に寄与しているとかもありそうです。プラスミド内の何らかの配列が偶然にバクテリアでの発現に寄与してたりっていうこともなきにしもあらずと思えますが。

(無題) 削除/引用 No.12908-4 - 2025/04/04 (金) 19:56:07 - G25 真核生物のプロモーターでも、下流にGFPなんかが入っているとコロニーが光ったりする

(無題) 削除/引用 No.12908-3 - 2025/04/04 (金) 19:46:06 - G25 されます。 過去トピに繰り返し対処法が議論されてますけど まずは培養温度を25℃くらいに下げて気長に待ってみて。 増殖は遅くなるけど、pUC系oriのプラスミドのコピー数が1/10くらいに下がって毒性が軽減されます。

(無題) 削除/引用 No.12908-2 - 2025/04/04 (金) 19:36:49 - おお 発現して悪さをしていたとして、それがCMV に依存しているとしか考えが向かないのはちょっと固定観念に囚われているのではないでしょうか。cDNAの中にたまたま大腸菌が発現で使う配列に似たものが有ればそこから発現している可能性もある｡ でも実際は何か発現する事が原因と証明された事例はほとんど無いのでその可能性が高いとしても他の可能性が否定されるわけでもないと言える｡なので挿入した配列が大腸菌に悪さをしていると私は控えめに言うことにしてます。 原因や表現の仕方はともかく、大腸菌に良く無い影響を与えているのだから菌体内のコピー数は減らしたい訳でプレートを30から室温で培養するとか、抗生物質の濃度を下げるとか言うのが正面切っての対処法です｡そのほかTFの時のヒートショックを37度でやる方がいいと言う話も聞きます｡ コンピテントの株を変えたら問題なく増えたと言う話もまあまああ聞いたり経験したりしてます。

大腸菌のコロニーが生えません 削除/引用 No.12908-1 - 2025/04/04 (金) 15:22:06 - T 哺乳類細胞での発現用プラスミドpcDNAに、機能を調べたい色々な遺伝子のcDNAをRT-PCRで増やして挿入して、大腸菌のコンピテントセルに導入して、アンピシリン含有LBプレートに蒔いています。ほとんどの遺伝子はコロニーが出現しますが、何回試してもコロニーが得られない遺伝子Aがあります。 大腸菌内でcDNAが転写、翻訳されている場合、Aの蛋白質が大腸菌に有害であり、Growthを抑制しているのかも知れないと考えたのですが、CMVプロモーターで発現が誘導されるpcDNAに挿入したcDNAは、大腸菌内で転写、翻訳されているのでしょうか？

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