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(無題) 削除/引用 No.12906-7 - 2025/04/10 (木) 05:33:28 - おお 特異的なバンドを見ることにおいて、Lysateを作るときの工夫も有効であったりします。目的によっては考えてみてもいいかもしれません。 たとえば膜タンパクであれば、膜だけを回収すれば目的の蛋白は濃縮されますし、検出が楽になります。同じような理屈で細胞質（しばし膜も含まれる）や核を回収するといった事もやり方かと思います。 そこまで意識せずともLysis Bufferによってある程度コントロールすることができます。RIPAはかなり強力なBufferで核のタンパク質や不溶性の蛋白複合体もたいてい抽出できます。 次に使われるのが１％TritonかNP-40を含むその他デタージェントを使われてないものがポピュラーです。核マトリクス成分の抽出力におとりますが、クロマチンや核マトリクス構造に関する蛋白やそれに強く結合している蛋白は抽出が困難だったりします（塩濃度を上げる、EDTAなどを加えるといったことでいくらか抽出力が上がります）。 さらにTritonなどの濃度を下げるかなしにするとCytosolicの可溶性タンパク質が中心のLysateを得ることができます。

(無題) 削除/引用 No.12906-6 - 2025/04/07 (月) 09:37:07 - 教員 ご存知かもしれませんが一応。 KO を作らなくても dsRNA を一緒にトランスフェクトして謎のバンドが消える、でも良いです。 一般的には dsRNA の取計はとてもよくワークしてノックダウンできます。最短なら２日で結果がわかります。 今日オリゴ発注 明日 dsRNA 作成、トランスフェクト 明後日 WB また、下記の方法でも良いと思います。 タグ付きの目的タンパク質を強制発現させる �@今回の抗体でWB �Aストリッピング �B同じメンブレンに対してタグに対する抗体でWB

(無題) 削除/引用 No.12906-5 - 2025/04/04 (金) 18:27:40 - 生物科 皆様ありがとうございます。 ノンスぺのバンドでもきれいに出ることがあるということは初めて知りました。ご指摘ありがとうございます。 独り言さんのご指摘通り、まずはKOで抗体特異性を確認しようと思います。 おおさんの博識さには驚愕です。ご丁寧にありがとうございます。 ひとつずつ可能性をつぶしていきたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12906-4 - 2025/04/04 (金) 08:27:44 - 独り言 目的タンパク質のKOでそのバンドが消失、または過剰発現細胞で増強されるのであれば、なにか面白ことがおきているのでは。 SDSでは崩れず、SS結合でもない、タンパク質が他タンパク質と共有結合してはたらくことがあります。 そうでないのであれば、抗体のただの非特異反応でしょう。確率的にはこちらのほうがよくあることです。

(無題) 削除/引用 No.12906-3 - 2025/04/04 (金) 02:38:57 - おお >とても綺麗に濃く、かつシングルバンドで確認できたのでただのバックグラウンドとは思えません。 そういうバックグランドというかノンスペが出ることもあるよ。あまり決めつけないほうがいい。 その蛋白の抗体のカタログ（同じ会社の製品でなくてもいい、できれば複数のソース）ではどれくらいのサイズで検出されてますでしょうか。たとえば糖鎖修飾ではペプチドから予測されるサイズと１００kDaぐらい違うこともあります（今回のケースではないような気がしますが）。 違う可能性では疎水性の部分で蛋白同士がアグってしまいSDSでも解消できないケース。たいていはサンプルバッファーを加えてボイルしたときに起こります。サンプルバファーを加えたあと比較的低い温度（５０度とか）で処理するとか４度においてオーバーナイトにするとか（低温だと２MEよりDTTのほうがいいかも）。もしボイルしたサンプルが使いたいなら同量の飽和尿素を等量加えて流すとかで解消できることが多いです。GPCRとかその典型的な例のようです。 抗体があまり良くない場合もありますがそういう場合、特定の解決方法はないです。 ネガコン、ポジコンがほしいところですね。

(無題) 削除/引用 No.12906-2 - 2025/04/04 (金) 00:45:20 - a サンプルが還元されていないとか？

WBのバンドについて 削除/引用 No.12906-1 - 2025/04/03 (木) 22:02:09 - 生物科 お世話になっております。 先日ウエスタンブロッティングを行ったところ、予想されたバンドとは違う高さにバンドが確認できました。 とても綺麗に濃く、かつシングルバンドで確認できたのでただのバックグラウンドとは思えません。 ただし、想定分子量が30kDa程度であるのに対して、確認された高さは90kDaほどであるため、これが目的のものであるとは全く言えないと思われます。 何かこのようなご経験のある方はいらっしゃいますでしょうか？ 検討できることがあればぜひご教授いただけると幸いです。 (他メーカーの抗体を買い直すということは予算の都合上厳しいです。申し訳ありません。)

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