4月から生物系M1になるものです。免疫染色について質問させてください。
今日、半年ぶりに免疫染色を行いました。プロトコルとサンプルはその時と同じ手順・条件のものです。サンプルは96well plateに播種した細胞にウイルスを感染させたものです。
1)細胞固定
ホルムアルデヒドを50ul加えて15minおきPBSでwash。
2)ブロッキング・透過処理・1次抗体付加
終濃度が各0.1% triton-x, 10%FBS in PBSで1次抗体液を1000倍希釈し、wellに100ul加え、2h置きその後PBS wash。
3)2次抗体付加
PBSで2次抗体液を1000倍希釈し、100ul加えて1h置き、上清を取り除いた後PBSを100ul加え、蛍光顕微鏡で観察
しかし顕微鏡でポジティブコントロールも含めて全く蛍光が観察されませんでした。原因として、2)でo.1% tritonではなく0.01% tritonで透過処理をしたことに90分経過後に気づき、残りの30分で0.1% tritonを100ul加えたことが原因だと考えられます。しかし、透過処理が甘かったとしても少しは蛍光が見られると思ったのですが、0.01%では厳しかったのでしょうか。
この結果の後で色々と文献を調べるとプロトコルが異なるとはいえ、0.01% tritonで透過処理をしている文献をいくつか見つけました。
また、透過処理が甘かったとしたら、現在ホルムアルデヒドで固定された細胞がPBSに入った状態で4℃で保管しているため後日2)からやり直したらうまくいく可能性はあるでしょうか。
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