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(無題) 削除/引用 No.12894-8 - 2025/03/26 (水) 07:59:57 - プラスミダ おおさん 普段はインサートチェックに使ったコロニーPCR産物をシークエンスに使っていますが、FwとRvで配列が違った際はミニプレップして読み直しました。 シークエンスは外注しており、前に外注先の業者に問い合わせてみたのですが、解決しませんでした。業者からは原因が分からないという答えではなく、答えません、という回答でした。 仰るようにFwとRvの配列が一致したものを使って実験は進めています。 実験が進まなくて困っているというよりも、何が起きているのかを知りたいというのが質問の意図です。 ただ、FwとRvの配列が違っていたクローンでも何度も読み直すと配列が一致することもあり、逆に1回読んでFwとRvの配列が一致していたクローンを何度も読んだら配列が違ったケースもあり、実験を進めながらもモヤモヤ感が残るのは否めませんが。

(無題) 削除/引用 No.12894-7 - 2025/03/25 (火) 08:04:46 - おお ちなみに精製したベクターから読んでますか？何らかの都合でPCRで増幅してから読んでますか？

(無題) 削除/引用 No.12894-6 - 2025/03/25 (火) 06:08:15 - おお たまにということなので、FwとRvから読んで一致しているクローンを使うということで進めばいいのかなと思ったんですが、そういう実験ではないのでしょうか？ 一致しないクローンは説明はさておいてなにか起きている言う事だろうから、そういうものを使って実験はできません。 テンプレートにニックがいっぱい入ってたりするかもしれませんが、お示しのような現象は今のところ個人的には見たことがありません。シーケンスは何処かに委託しているのでしょうか？ならそちらで相談してみてもいいかもしれません。いろいろなデーターやトラブルなど経験しているでしょうから。

(無題) 削除/引用 No.12894-5 - 2025/03/24 (月) 22:37:48 - プラスミダ seqさん インサートがタンデムに入っていることは無さそうでした。 インサートが短いので1プライマーでインサート全長＋ベクターのMCS両側が読めています。 ライゲーション後のインサートチェックはコロニーPCRで行っていますが、PCR産物の長さもインサート1つ分でした。

(無題) 削除/引用 No.12894-4 - 2025/03/24 (月) 10:40:16 - seq インサートがタンデムに複数挿入されているということはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.12894-3 - 2025/03/23 (日) 21:37:03 - プラスミダ おおさん お返事頂きありがとうございます。 私の扱っているインサートは200-500bp程度でプライマーはインサート末端から100塩基ほど離した位置（ベクター内部）に作っています。 波形を確認していますが波形は綺麗でピークの分離もよく高さも十分で、綺麗に読めていないという感じではなく、綺麗に読めているけど塩基が違うという結果です。

(無題) 削除/引用 No.12894-2 - 2025/03/22 (土) 10:06:31 - おお 波形とかみましたか？ 部分的に読みにくかったりとかの場合もあります。 またプライマーの近傍はバンド幅がありすぎてちゃんと塩基をアサインできないですし、１kb読めるとされていてもその前にシグナルが減衰してしっかり読めてないこともあります。

プラスミドのシークエンスについて 削除/引用 No.12894-1 - 2025/03/22 (土) 09:15:59 - プラスミダ プラスミドベクターのMCSにインサートを入れてインサートの配列をサンガーシークエンスで読んだ際に、フォワード側から読んだ配列とリバース側から読んだ配列が異なることがたまにあります。 読めた配列が異なる、というのは1塩基だけ違っていたり、数塩基欠損しているという感じで、全く別物の配列という訳ではありません。 シークエンスプライマーを変えても同じ現象が見られました。 読む方向によって読めた配列が異なる原因として考えられることは何でしょうか。 ご教授いただければ幸いです。よろしくお願いします。

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