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(無題) 削除/引用 No.12886-3 - 2025/03/18 (火) 09:41:29 - Testimo おお先生 ありがとうございます。 Stbl3に変えたところ、期待通りの数のコロニーが生じました。 オーバーナイト培養で色も白です。 菌株を変えることの有用性につき、学ぶことができました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12886-2 - 2025/03/18 (火) 02:13:32 - おお そういうプラスミドはたまにあります。大抵の場合増殖が遅くコロニーが確認できるのに倍程度の時間がかかったりします。気をつけたいのは２日ほど培養すると酵母も増殖してコロニーができることです。もしかしたら赤いのはそういう事かもしれません。培養すると匂いなどでなんとなくわかったりもしますけど。 そういう増殖に影響するプラスミドのコロニーは液体培地ではもっと扱いにくかったりもしますが、対処方法としては３０度から室温で増殖させる、抗生物質濃度をプラスミドが維持できる範囲で下げる、大腸菌の菌株を変えてみるなどです。プレート上でもこれは有効かと思われます。

大腸菌の色が赤っぽい？ 削除/引用 No.12886-1 - 2025/03/17 (月) 22:50:39 - Testimo お世話になります。 お助けいただきたく、トピックを立てさせていただきます。 海外から取り寄せたplasmid DNAを大腸菌(XL-10 gold)に形質転換していますが、コロニーの数が期待する値に比べて非常に少ないです。10^4ほど出てもいいくらいの量でも2-3個です。 また、そのコロニーは増殖が非常に遅く、24時間でようやくコロニーだと判断できるくらいです。 それをmini cultureすると増殖は活発でしたので、そのままmidi cultureを行い、midiprepしたところ、plasmid DNAは全く回収されませんでした。ちなみにmini culture後に一度遠心して、菌体をフレッシュなLB+Ampで再度懸濁してからmidi cultureを行いました。 他のplasmid DNAは問題なくこれまで同様増えていますが、今回のplasmid DNAは初めてこのような問題に直面しています。また、コロニーの色がやや赤っぽいです。 plasmidのバックボーンはpReceiver-M02と呼ばれるもので、GeneCopoeiaというところから購入したと思われます。 現在は、菌株を変えてStbl3で行っています。 なお、このplasmid DNAを293Tや他の細胞にtransfectionすると、期待通りタンパク質の発現が確認されました。 海外のラボに「どうやってplasmid DNAを増幅させていますか？」と聞いたところ、companyにlarge prepまで依頼したため、自分らで増幅はしていないとの回答でした。 菌株を変えてどうなるかは明朝結果が出ますが、非常に悩んでいます。 どうかアドバイスいただけましたら幸甚です。 どうぞよろしくお願いいたします。

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