全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.12883-8 - 2025/03/22 (土) 00:23:11 - おお > タンパクには抽出されにくいもの、されにくいものが タンパクには抽出されやすいもの、されにくいものが 訂正します

(無題) 削除/引用 No.12883-7 - 2025/03/22 (土) 00:21:38 - おお >[Re:6] 学会前の大学院生さんは書きました : > お忙しい中、検討いただきありがとうございます。 > > 4. transferがｾﾐﾄﾞﾗｲ式なのですが、タンク式にして方がいいのでしょうか… 特にセミドライで不都合は感じません。タンク(ウェット)は高分子のトランスファーで有利です。 > 5. CBB染色で確認した所、15kDa、10kDaまでまっすぐなバンドはいくつか観察されました。タンパク抽出はうまくいっていると言えるでしょうか。 > タンパクには抽出されにくいもの、されにくいものがあるのでバンドが見れたからといってあなたの見たいタンパクが抽出されているとは限りません。 トランスファー後マーカーやポンゾーで染めたタンパクがその分子量あたりで、裏っ側でも染まっているようでしたら、少しトランスファーの時間を短縮して下さい。

(無題) 削除/引用 No.12883-6 - 2025/03/21 (金) 23:58:44 - 学会前の大学院生 お忙しい中、検討いただきありがとうございます。 1. membraneはのporeは0.22のものを使用しています。 2. 次回トリシンページにしようと思っています。アドバイスいただきありがとうございます。 3. 現状、ポジコンは使用していないので検討します 4. transferがｾﾐﾄﾞﾗｲ式なのですが、タンク式にして方がいいのでしょうか… 5. CBB染色で確認した所、15kDa、10kDaまでまっすぐなバンドはいくつか観察されました。タンパク抽出はうまくいっていると言えるでしょうか。 ひとまず、トリシンページで様子をみたいと思っています。

(無題) 削除/引用 No.12883-5 - 2025/03/20 (木) 05:04:56 - 別のたこ 既出ですが とりしんぺーじにする。 実績のある抗体をつかう。 membraneのporeが0.45なら0.22に変更。 転写時間、transfer bufferのメタノール濃度の最適化。 あと、現状でポジティヴコントロールの検出可否はどうなんでしょう？

(無題) 削除/引用 No.12883-4 - 2025/03/16 (日) 08:56:12 - おお >低分子になっていくほどそれぞれのサンプルで逆スマイリング？のようにガタガタになっていくのが気になる >マーカーは15kDa、10kDaまでしっかりとまっすぐ流れています。 LC3は１０kDa以上なので今回は問題視する必要もないかと思いますが。 もし気になるならなにかそのへんのサイズの手持ちの抗体でWBしてみるといいかと。 低分子でありがちなのは膜からすり抜けてしまって検出感度が落ちたりするという事ですが、NCならPVDFに変えてみる（たまにどういうわけか逆のほうが良かったりする）。Transferの時間をそのあたりがちょうどゲルから出るぐらいの時間でとめる。Transfer bufferを工夫する（メタノールを３０％から４０％とか）。こういうことはちょっと試行錯誤になるので、ある程度経験のある方の細かい条件を開示してくれる人がいるといいですね。

(無題) 削除/引用 No.12883-3 - 2025/03/16 (日) 08:17:04 - おお >GAPDHは出ているのでタンパク抽出には問題無い、と考えてよろしいでしょうか？ No. >低分子になっていくほどそれぞれのサンプルで逆スマイリング？ よくあることです。Tris-Tricineのオリジナルを見てもそうなってます（ただガタガタにはなってない）。がたがたなのは多分夾雑物がじゃまになってるのかもしれません。できることはLysisを工夫するか、Microdialysisができるならそう言うのでなるべくタンパク質以外の夾雑物を除くとか。

(無題) 削除/引用 No.12883-2 - 2025/03/15 (土) 23:45:52 - たこ １，細胞によってLC3の見やすさが異なる。LC3のブロットが論文によく乗っている細胞をポジコンに使用する。 ２，LC3-IIのポジコンとして、クロロキンやバフィロマイシン処理した細胞を用意して、LC3-IIが増加したものが検出できているか。 ３，LC3抗体によって、検出しやすさは異なる。実績のある抗体を2，3種類試すとよい。日本だったら、MBLとかCSTあたりに良いLC3の抗体がある気がする。

低分子のタンパク質をWBで検出できない 削除/引用 No.12883-1 - 2025/03/15 (土) 23:06:09 - 学会前の大学院生 LC3を検出したく、WBを行なっております。 GAPDHはしっかりと検出できるのですが、LC3がなかなか検出出来なくて困っています。 GAPDHは出ているのでタンパク抽出には問題無い、と考えてよろしいでしょうか？ また、泳動の際に、途中まではまっすぐ流れているのですが、低分子になっていくほどそれぞれのサンプルで逆スマイリング？のようにガタガタになっていくのが気になるポイントではあります。 ゲルはbioradのanyKdを使用しております。 マーカーは15kDa、10kDaまでしっかりとまっすぐ流れています。 タンパク抽出から転写、抗体、撮影まで、どの段階の修正が必要かご意見をお聞かせいただきたいです。 まだウエスタン初心者ですが、よろしくお願いいたします。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---