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(無題) 削除/引用 No.12882-6 - 2025/03/22 (土) 00:26:40 - おお ちょっと確認しましたが前述の組織でRNAseq に回したものはRIN 8強でした｡ 結果に問題があったとは思ってません。

(無題) 削除/引用 No.12882-5 - 2025/03/21 (金) 14:00:43 - おお >RIN score 8でRNA-seqに飛び込むと綺麗なデータが出ない 色々見てますとRIN8ぐらいだと結構いいスコアのようなきがします。これぐらいですと28S:18S rRNA ratioが2:1で維持されているようですし、RNAに大きなダメージはなさそうにもおもえます。

(無題) 削除/引用 No.12882-4 - 2025/03/20 (木) 02:31:50 - おお >[Re:3] Cas9さんは書きました : > > 浮遊性細胞の場合、継代において、どうやって、死細胞を除去していますか？ > 普通はしないというか、経験上したことはありません。 必要があればパーコールなどの密度勾配を使うのは昔からある手法です。 その他キットなども販売されています。dead cell removeなどのワードで検索すると数社キットが見つかります。 RNAseq用に死細胞を除くというのなら、どの程度精製したRNAのRINに影響があるかわかりませんが、やってみてもいいのかもしれません。ただし除去の間ある意味特殊な環境に細胞が置かれるとは思います。短時間で分けれるものがあれば影響は少ないかもしれません。 Viabilityが９０％ぐらいならまあそういう細胞もあるのかなと思います。特殊な細胞ではなんかいつも調子悪そうというのもありますので。ちなみに大昔にほぼ通常状態のHEKの死細胞をカウントするとだいたい５％ぐらいはポジになっていたと言われたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.12882-3 - 2025/03/15 (土) 21:01:52 - Cas9 85%は一番悪い値で、平均は、90%位だった気がします。 抗生剤なしで、一番いいときは、95%くらいは維持出来ていた気がします。 浮遊性細胞の場合、継代において、どうやって、死細胞を除去していますか？

(無題) 削除/引用 No.12882-2 - 2025/03/15 (土) 10:34:47 - おお mRNA検出のため組織から抽出したRNAを送ったら一つだけ分解が進んでいたようで、RINが７未満ではやれませんと言われたことがあります。しかしながらやりようはあってある程度分解されているばあい、ちがうやり方はあるからそうするかどうかと尋ねられたことがあります。 RIN scoreが8でやるかどうかは、何処かに依頼するのならそこの人に聞いてみると良いでしょう。 ＞抗生剤下の過酷な環境に置くとRNAの質が落ちる可能性はありますでしょうか。 普通はないと思う。だって耐性を獲得して増えてきたのだし、増殖していくうちにより強い（耐性の）細胞がドミナントになっているはずだから。 しかし８５％はちょっと低いように思えるけど、親株で（もちろん抗生物質抜きで）、同じ状況でどれくらいの生存率でしょうか？ 継代から培養した時間が長く細胞がヘタってきているとか、導入した遺伝子が細胞毒性があるとかちょっと違うことを疑ってまう。 ＞質の良いRNAそのために、抗生剤の濃度を下げるなど、 RNAのために下げるというのはないと思いますが、細胞や導入した遺伝子があまり細胞に悪さしてないなら、抗生物質なしでも維持できます（ゲノムに取り込まれているので）。一度耐性株として樹立したあとの維持には抗生物質の量を下げている人もいると思います。

Puromycin selection後にRNA-seq解析 削除/引用 No.12882-1 - 2025/03/15 (土) 10:06:34 - Cas9 浮遊細胞にレンチウイルスで遺伝子を導入して、puromycin selection。2週間ほど培養して、RNAを抽出したのですが、RIN scoreが8で低いです。 Puromycinによる死細胞が蓄積していた？という仮説を立てたのですが（計測した限りは85%でしたが、、、何か数値に表れないものがあるのかなと思っています）、抗生剤下の過酷な環境に置くとRNAの質が落ちる可能性はありますでしょうか。抽出過程の可能性も完全には否定できませんが2回とも同じ結果でした。 質の良いRNAそのために、抗生剤の濃度を下げるなど、何か工夫はあったりしますでしょうか。 RIN score 8でRNA-seqに飛び込むと綺麗なデータが出ない気がしているのですが、低いRINでトライされた方いますでしょうか。

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