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(無題) 削除/引用 No.12876-9 - 2025/03/14 (金) 18:18:38 - G25 なにを見たいかにより、それでも影響がすくない用途だからとか、あるいはダメ元であえてやってみるのかもしれないけど。 融解時のRNAの分解もさることながら、細胞のストックのための凍結だと保護剤いれたり徐冷で凍結したりで、遺伝子発現プロファイルが変わってるかもね。 どのような用途で使うRNAなんでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.12876-8 - 2025/03/14 (金) 03:33:31 - おお >うまく起きませんでした。 そんな細胞を使って何が見れるのかと、、、、 >自然に融解するのを待って良いものでしょうか？ 書いても読んでくれないし。 >細胞の状態が悪いのか、うまく起きませんでした。 先方と相談してください。

(無題) 削除/引用 No.12876-7 - 2025/03/14 (金) 01:57:12 - 実験初心者 コメントありがとうございます 今回サンプルに用いている凍結細胞は、培養用に凍結された細胞なのですが、外部から譲り受けたもので、細胞の状態が悪いのか、うまく起きませんでした。ですので、細胞を起こすのを諦めて、直接凍結細胞から抽出を試みております。 ちなみに、凍結状態でLysisBufferを加えて行なったことがないのですが、Lysisを加えた後は、自然に融解するのを待って良いものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12876-6 - 2025/03/14 (金) 01:18:40 - おお >実際論文で明記していることもおおい そういうことですので、培養用に凍結した細胞から直接RNAを抽出したならそう論文に明記することになります。

(無題) 削除/引用 No.12876-5 - 2025/03/14 (金) 01:11:10 - おお RNAように浮遊細胞を培地ごと急速凍結しているのなら、お使いのキットの血液から回収するときのプロトコールで凍結しているボリュームにおおじてLysis bufferを使い、即座にLysisすることをおすすめします。凍結したままLysis bufferに移しポリトロンとか急速にかき混ぜれるようなもので融解したときに即座にLysis bufferが浸透するようにしたほうがいいです。 すでに述べましたが、培養用に凍結しているなら私なら凍結したものから直接精製するな（しないように）と指示します。量が必要であってあっても培養に戻して増やせば量は取れるでしょう。 普通は何の特別な状況（コンフルでの生理的状況を調べるとか、、、）でのサンプルリングする必要がないなら、対数増殖期にサンプリングするのが暗黙の了解（実際論文で明記していることもおおい）だと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.12876-4 - 2025/03/14 (金) 00:30:40 - G25 凍結保存している細胞の懸濁液は何でボリュームはいかほど？ 精製システムはどれ（lysis buffの組成は）？ 付着細胞だと、培地を洗い流して培養皿ごと凍結保存して、精製するとき凍った状態にいきなりlysis buffをぶっかけてlysate を回収なんてこともするけど。

(無題) 削除/引用 No.12876-3 - 2025/03/14 (金) 00:13:50 - あの セルラインなら、培養再開して、さらに二回ぐらいパッセジした方がいいという話を聞いたこともあります。

(無題) 削除/引用 No.12876-2 - 2025/03/13 (木) 22:51:11 - おお 凍結して培養のために保存しているなら普通に培養してからの方がいいと思うのですが、そう言う事じゃないのですか？凍結する過程で色々な反応が起きている可能性があるので。

凍結細胞からのRNA抽出 削除/引用 No.12876-1 - 2025/03/13 (木) 20:59:54 - 実験初心者 医学系研究科の大学院生です ある実験で、凍結細胞からRNA抽出の必要があるのですが、できるだけRNAの分解が起こらないよう、 細心の注意を払って実験を進めたいです。 凍結してある細胞は、浮遊系の培養細胞です。 現在のプロトコールでは、RNAの量が必要なため、凍結チューブ数本を融解し、遠心でペレットにした後PBSで洗浄し、上清を取り除いた後、LysisBufferを入れてホモジナイズしています。 自分的に気になっているのは、凍結チューブの細胞を融解してからLysisBufferが添加されるまでに時間がかかっている点です。チューブ数本分のペレットを１本に集めてから、PBSで洗浄して、、、と室温の作業となりますので、RNAの分解が進んでしまうのでは？と心配です。ボスはそれほど気にしなくて良いと言っているのですが、他の研究室ではどのようにしているのかな、と気になったので質問させていただきました。 みなさんの手法や、凍結培養細胞からRNA抽出する際に気をつけた方が良い点などありましたら教えてください。

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