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(無題) 削除/引用 No.12872-5 - 2025/03/14 (金) 10:24:41 - gdtm 似た経験はないので傍目からの意見です。 継代時との違いがトランスフェクションであれば、トランスフェクションにより何らかの高分子が合成されているのか、細胞膜や核膜が弱くなりDNAが出てきたのかもしれないと考えました。 洗浄過程で細胞が壊れているなら溶解する前に細胞が損失してしまうので、プレートに直接lysis bufferを入れてサラサラになるまでピペッティングやニードルを通した方がいいでしょう。 核酸ではない高分子なら、ペレットにlysis bufferを入れた後、超音波処理やニードルを通して塊を完全にほぐし、遠心して上清を使用するのが良さそうに思いました。

(無題) 削除/引用 No.12872-4 - 2025/03/13 (木) 16:27:24 - おお 経験上Lysatesが粘ることはないと言う主張で書き込みましたが、細胞がいくらか死にかけているとかいう場合に置いてその限りではないかも知れません。その場合、そのような状態で測るべきかと一度考察が必要かもしれません｡また使っている細胞によっては核は壊れやすかったりするかもしれません。 いずれにしろそう言う状態で測る必要があるならlysis の時に工夫するのが良いと思います。DNaseとか加えるとか、物理的に粘性が出ないようにするとか(ポリトロン、超音波、ニードルを通すなど］。後者は色々とステップが増えるので前者がいいかなと思ってはいますが、実際使用している事があるかはよくわかりませんが。

(無題) 削除/引用 No.12872-3 - 2025/03/13 (木) 09:57:28 - TS おおさんがおっしゃっている通りですが、nさんの現状のプロトコールは不必要なステップがあって、かえってトラブルを起こしているのだと思います。 接着細胞の場合、実験終了後に培地を除いて（PBSで洗っても良いけどたぶん必須ではない）、そこにLysis bufferを加えて（おおさんが示してるようなもの、これ、私も自作で使っています）、プレートを手でくるくるとよく混ぜます。で、ピペットで上清の一部を384穴プレートに移して（わたしは96穴とかを使うけど）、基質を加えて発光を測定すればいいでしょう。Lysis bufferを加えたあと、ピペッティングしたり、そのあと遠心して上清を使ったりしても良いですが、Lysis bufferで細胞膜に穴があけば、細胞内に発現したLuciferaseは容易に上清中に出てくるし、細胞の残渣もなるべく取らないようにする程度で問題ないはずです。 Lysis bufferに溶かした細胞溶解液は、凍結保存可能です。 ドロドロするのは、PBSでピペッティングをし過ぎて、核が壊れているのではないかと。

(無題) 削除/引用 No.12872-2 - 2025/03/12 (水) 23:02:06 - おお >[Re:1] nさんは書きました : > ↓細胞の調整 > 1)細胞をトリプシン処理してはがしそこに培地(DMEM等)を適量加え、1.5ml tubeに移す トリプシン処理は必要ないと思います。well をPBS(剥がれやすいなら、カルシウム、マグネシウムの入った同等のバッファ)で洗い直接のlysis buffer を加えれば良いです｡ > 5)buffer,triton,基質を適量混ぜる > > 4)、5)から各10ulとり384 plateに加え発光を測る > > <質問> > 4)でピペッティングする際にかなり強く行っているのですが、ペレットを完全にはほぐすことができません。ペレットが粘性?をもってネバネバした感じになります。 bufferの組成は？ 因みに昔使ったプロメガのキットの組成は Luciferase Cell Culture Lysis Reagent, 1X 25mM Tris-phosphate (pH 7.8) 2mM DTT 2mM 1,2-diaminocyclohexane-N,N,N &#769;,N &#769;-tetraacetic acid 10% glycerol 1% Triton&#174; X-100 でねばねばしたりすることはなかったです。なんらかの理由でクロマチンが崩壊して必要のないDNAが溶出していると思われます。 > > また、サンプル数が多い場合、長時間(30〜1時間程)triton処理をしたら結果に影響は出るでしょうか。 それは改善する見込みがないのでやめた方がいいでしょう。 > > 普段細胞をpassageする際は、遠心後にペレットダウンした後に培地を加えてピペッティングしても細胞がネバネバした感じにはならないのに、なぜこの時だけなるのでしょうか。 上記に理由を書きました。 >測る時まで-20℃でペレットを-20℃で数日保管していることが影響が出ているとか? 凍結保存できますのでそれで変になることはないです。lysis buffer 加えた後遠心して、核などの不溶性のものを除いてますか？

培養細胞におけるルシフェラーゼ活性の測定について 削除/引用 No.12872-1 - 2025/03/12 (水) 21:14:01 - n 生物系専攻のM1のものです。初めて質問させていただきます。 12well plateなどのwell上の細胞にルシフェラーゼ発現plasmidをtransfectionし、その活性を調べ際の質問です。 研究室所属時に教えていただいた方法を下記に記載します。簡潔に書くため一部過程は割愛します。 ↓細胞の調整 1)細胞をトリプシン処理してはがしそこに培地(DMEM等)を適量加え、1.5ml tubeに移す 2)遠心してペレットダウンし、その上清を捨て、PBSを加えて再度遠心(wash目的) 3)上清を捨て、ペレットのみにする 4)PBSを100ul加えピペッティングし、ペレットをほぐす ↓基質調整 5)buffer,triton,基質を適量混ぜる 4)、5)から各10ulとり384 plateに加え発光を測る <質問> 4)でピペッティングする際にかなり強く行っているのですが、ペレットを完全にはほぐすことができません。ペレットが粘性?をもってネバネバした感じになります。なので、発光を測る際に、このほぐしきれていないペレットを加えたサンプルとペレットを加えていないサンプルでは発光に誤差が出るのではないかと思いました。また、ペレットを吸わないようにしたとしても各サンプルで細胞のほぐれ具合が異なったら同量吸っても誤差が出るような気がします。 解決策として、tritonを基質側ではなく、細胞側(4)の過程)に加えて細胞を壊せば同じ条件で測定できると考えたのですがどうでしょうか。 また、サンプル数が多い場合、長時間(30〜1時間程)triton処理をしたら結果に影響は出るでしょうか。 普段細胞をpassageする際は、遠心後にペレットダウンした後に培地を加えてピペッティングしても細胞がネバネバした感じにはならないのに、なぜこの時だけなるのでしょうか。測る時まで-20℃でペレットを-20℃で数日保管していることが影響が出ているとか? 長々と書いてしまいましたが、よろしくお願いいたします。

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