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(無題) 削除/引用 No.12864-7 - 2025/03/08 (土) 00:57:57 - ウェスタン初心者 詳しい説明ありがとうございました。 研究対象のタンパク質の発現量が少ない場合、発現量の多い内在性コントロールでの補正は難しいのですね。トータルタンパク質による補正だとメンブレンを切らない分抗体溶液は多く必要になってしまいますが、最も有効な方法だと思いました。

(無題) 削除/引用 No.12864-6 - 2025/03/07 (金) 21:03:02 - JJJ ミニゲルで20マイクロg/laneですと多いほうだと思います。存在量の非常に少ないタンパク質の場合を別にすると、化学発光法ならば4~8マイクロg/laneの範囲で大抵の場合、問題なくウェスタンで十分検出できます。20マイクロg/laneですとGAPDHでしたらCBB染色したならバンドがわかるくらいの量があると思いますので、そのように大量のGAPDHが膜に転写される際に、膜への単位面積あたりの結合容量を超えてしまい膜に結合しきれないGAPDHが生じているように思います。これらが、膜に結合しているGAPDHの上に重なってのる状態になりさらにそれに抗体が結合するという立体的な構図を想像していただければと思います。PVDFの親水化等とは関係ありません。タンパク質量が多すぎて一部のabundantなタンパク質が膜の結合容量を超えていることが原因ではないかということです。この状態ですとシグナル強度は大きすぎてすでに頭打ちの状態になっており定量性がないので、内在性コントロールとしての役割も期待できません。（いわゆるhigh impact journalでも明らかにそのように見えるデータが掲載されているケースは時々見かけます。どのような実験手法も方法上の限界やピットホールがあります。westernは定量的分析はどちらかというとあまり得意ではない実験法です。でも結構できる方でもあまり意識していないことあります） 研究対象のタンパク質が検出できる範囲でなるべく少ないタンパク質アプライ量で検討することを勧めます。また上述のようなことはGAPHDに限らず内在性コントロール全般が内包する問題点ゆえ、最近は膜に転写されたタンパク質全体を染色してノーマライズすることが推奨されるようになりつつあり、色々なメーカーから染色液なども市販されています。ていうか自作もできます。もし興味あれば試してみてください。 https://www.atto.co.jp/technical_info/blotting/total-protein

(無題) 削除/引用 No.12864-5 - 2025/03/07 (金) 17:52:39 - ウェスタン初心者 おおさんコメントいただきありがとうございます。 メンブレンに抗体溶液をドロップした上にカットしたハイブリバックを乗せて静置するのは試してみましたが、あまり効果はありませんでした。 また、別の方がチップケースを乗せてるのを見て、平らなもので挟むこともしましたが残念ながら効果ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.12864-4 - 2025/03/07 (金) 17:47:17 - ウェスタン初心者 jjjさんコメントいただきありがとうございます。 ゲルのサイズは8×8cmです。 20μg/laneでアプライしています。 一般的なアプライ量の範囲内かと思うのですが、膜との結合が影響するのであればPVDF膜の親水化不足の可能性もあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12864-3 - 2025/03/07 (金) 15:15:51 - おお 数ミリぐらい入れるWB用の容器でもなんでもいいですから平らなところにMembraneをおいてその上に抗体反応液をドロップしてパラフィルムとかなんか平らなもので上からカバーするという方法もありますが、、、抗体溶液を先にドロップしてMembraneで覆ってから更にパラフィルムとか。 ハイブリバッグみたいなのにヒートシーラーとかで封入しているのですよね。アイデアとして、その封入したものを平らなガラスとかプラスティックみたいなのでハサミクリップで周りを挟むと比較的バッグの中が均一にならないかしら。

(無題) 削除/引用 No.12864-2 - 2025/03/07 (金) 13:10:36 - JJJ ２点ほど教えてください。 ゲルのサイズはおおよそでどのくらいですか。 タンパク質のアプライ量はどのくらいですか。 GAPDHは元々細胞内での存在量が非常に多いタンパク質ゆえ、泳動するタンパク質の量が多すぎると転写の際に膜の面積あたりの保持できるタンパク質量の限界に達します。膜に結合しきれないものはタンパク質の上にタンパク質が重なるような（お正月のお餅のお供えみたいな、あるいは山盛りのような）状態になります。その場合、抗体反応で抗体と結合するのは一番外側のGAPDHですが、このような位置のGAPDHは、膜に結合しているわけでなく膜に結合したGAPDHの上に不安定に乗っているだけですので洗浄操作などの際に脱落しやすく、もし脱落した場合は抗体も一緒にとれてしまいますので抗体が外れた部分はシグナルが減弱したり完全に白抜きになることもあります。このとれ方は偶発的でありランダムですので、結果としてシグナルのばらつきとしてみられるのではないかとおもます。適正な量のタンパク質を泳動することで改善できるとおもます。

ウェスタンブロッティングの染色ムラ 削除/引用 No.12864-1 - 2025/03/07 (金) 11:14:47 - ウェスタン初心者 現在実験でウェスタンブロッティングを実施していますが、gapdhのバンドの濃さが揃いません。 一つのゲルに同じサンプルを同量ずつアプライしてもムラが生じるので、転写から発色の過程の問題だと思います。 個人的には1次抗体反応のフイルムの歪みで生じるのかもと思っているのですが、液量を削減しつつ均一に反応させる方法は何かありますか？ 転写はタンク式で実施。 ブロッキング、tbst洗浄は液高2mmで振盪。 ブロッキング後、目的のバンドの位置のメンブレンを切り出し1次抗体は約60μL/cm^2の溶液とフイルムに封入して4℃O/N振盪。 2次抗体は液高3mmで振盪。 市販の検出試薬で発光させて撮影しています。

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