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免疫染色の染色性が一致しない トピック削除
No.12861-TOPIC - 2025/03/05 (水) 10:54:45 - YM
免疫染色をした際、使用している抗体に誤りはないにも関わらず、染色性が一致しない現象がたまにあります。
(例：細胞膜にDAB陽性になる抗体が核にDAB陽性を示す)
なぜこのようなことが起こるのかわかる方はいらっしゃいますでしょうか。
使用している切片は「ヒト FFPE」です。

プロトコールおよび試薬は下記のとおりです。(熱賦活の場合)
改善点がありましたら、ご教示いただけますでしょうか。

1.脱パラ→水洗→PBS
2.抗原賦活　121℃、15分　(免疫染色用圧力鍋：Dako社)
3.室温になるまで机で冷ます　30分
4.PBS洗浄　3分×3
5.0.3%H2O2加メタノール　室温15分
6.PBS洗浄　3分×3
7.正常ヒツジ血清(10％)　室温10分
8.PBS洗浄　3分×3
9.一次抗体　4℃　一晩
10.PBS洗浄　3分×3
11.二次抗体-1(ビオチン)　室温30分
12.BS洗浄　3分×3
13.二次抗体-2(HRP標識ストレプトアビチン)　室温30分
14.PBS洗浄　3分×3
15.DAB発色　検体により変動
16.PBS→水洗　軽く
17.対比染色　ヘマトキシリン　約20秒
18.軽く水洗
19.脱水→透徹→封入

試薬内訳
自家調整：PBS(pH7.0)、抗原賦活化液、0.3%H2O2加メタノール、正常血清
市販試薬：二次抗体(LSAB2 Kits,Universal,HRP.Rabbit/Mouse K0675 Dako社)
　　　　　DAB試薬(Liquid DAB+Substrate Chromogen System K3468 Dako社)
抗体希釈液(試薬媒体試薬 AR9352 Leica/BOND社)
　
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(無題) 削除/引用
No.12861-4 - 2025/03/06 (木) 17:44:18 - ２

いろいろなことが考えられると思います。細胞内局在は動的なものですので組織や細胞により、あるいは細胞の置かれた環境によって局在が異なることもあると思います。
可能性としては低いのかもしれませんが一つ注意すべきこととして、アルデヒド系試薬での固定の場合、固定中にタンパク質が動いて局在が変わることがあることです。培養細胞に蛍光タンパク質を発現させてホルマリン固定中の様子をライブイメージングしたらもともと核にいたこのタンパク質は細胞質に移動して、固定後10分には細胞質タンパク質になってたという動画をどっかの論文で見ました。固定剤による細胞への傷害に対する反応もしくは細胞死の過程での随伴現象と捉えていました。ほんとかどうかは定かではないですが有機溶媒固定でもそういうことがあるとかいう話もあるようです。組織の場合はどうしても固定に長い時間かけざるを得ないので、その間に局在が変わるタンパク質もそれなりの数あるかもしれません。なのでsubcellular fractionationなど別の方法でも局在を確認した方が良いように思います。

(無題) 削除/引用
No.12861-3 - 2025/03/06 (木) 08:51:33 - ねずみ
培養細胞のIFでの経験であり、どの抗体でもというわけではありませんが、指示書通りでは一次抗体が濃すぎて非特異の染色が起こったことはあります。
その抗体のターゲットは特定細胞の核に存在するのですが、すべての細胞の核が染まってしまい（染色の強さにも差がなかった）、使えない抗体なのだろうか？と困っていました。試しに抗体を1/5の濃度に薄めてみたところ特異的染色ができました（目的外の細胞はきれいに陰性）。
同様に抗体が濃すぎて目的外の核が染まってしまった経験は3回ほど（つまり3種類の抗体）経験があります。
抗体によりけりだと思いますしIHCではまた違うのかもしれませんが、もし目的の染色がありつつ目的外の（と思われる）染色がみられるというケースであれば一次抗体を薄めてみるのもありだと思います。

(無題) 削除/引用
No.12861-2 - 2025/03/06 (木) 03:06:50 - おお
核膜にも存在している可能性はないですか。

免疫染色の染色性が一致しない 削除/引用
No.12861-1 - 2025/03/05 (水) 10:54:45 - YM
免疫染色をした際、使用している抗体に誤りはないにも関わらず、染色性が一致しない現象がたまにあります。
(例：細胞膜にDAB陽性になる抗体が核にDAB陽性を示す)
なぜこのようなことが起こるのかわかる方はいらっしゃいますでしょうか。
使用している切片は「ヒト FFPE」です。

プロトコールおよび試薬は下記のとおりです。(熱賦活の場合)
改善点がありましたら、ご教示いただけますでしょうか。

1.脱パラ→水洗→PBS
2.抗原賦活　121℃、15分　(免疫染色用圧力鍋：Dako社)
3.室温になるまで机で冷ます　30分
4.PBS洗浄　3分×3
5.0.3%H2O2加メタノール　室温15分
6.PBS洗浄　3分×3
7.正常ヒツジ血清(10％)　室温10分
8.PBS洗浄　3分×3
9.一次抗体　4℃　一晩
10.PBS洗浄　3分×3
11.二次抗体-1(ビオチン)　室温30分
12.BS洗浄　3分×3
13.二次抗体-2(HRP標識ストレプトアビチン)　室温30分
14.PBS洗浄　3分×3
15.DAB発色　検体により変動
16.PBS→水洗　軽く
17.対比染色　ヘマトキシリン　約20秒
18.軽く水洗
19.脱水→透徹→封入

試薬内訳
自家調整：PBS(pH7.0)、抗原賦活化液、0.3%H2O2加メタノール、正常血清
市販試薬：二次抗体(LSAB2 Kits,Universal,HRP.Rabbit/Mouse K0675 Dako社)
　　　　　DAB試薬(Liquid DAB+Substrate Chromogen System K3468 Dako社)
抗体希釈液(試薬媒体試薬 AR9352 Leica/BOND社)
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