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(無題) 削除/引用 No.12859-23 - 2025/03/12 (水) 15:14:23 - aa 勘違いしておりました。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.12859-22 - 2025/03/11 (火) 21:47:46 - おお >[Re:20] aaさんは書きました : > 皆さんたくさんのご意見ありがとうございます。 > > トリプシンの影響はないのではないかと考えています。回収前、つまりトリプシンを使う前に細胞の様子がおかしくなっています。 > いや、回収ではなくてまく時にトリプシン使うでしょ。

(無題) 削除/引用 No.12859-21 - 2025/03/11 (火) 21:47:39 - mont インキュベーターの温度やCO2のキャリブレーション、インキュベーターの消毒、水の交換や 消毒は大丈夫ですか？うまくいっている人も同じインキュベーターを使ってますか？ マイコプラズマのチェックはどうやってやってますか？経験上、これまでに定期的にチェックする習慣がなければ、かなりの確率で感染してます。感染してても、普通に増殖しているように見えるので、まず気がつきません。今回の問題とは別かもしれませんが、マイコプラズマ検査は定期的に行った方が良いです。私のラボでは月に1回、当番制でラボ全員の細胞をPCRでチェックしています。毎月チェックしてても、陽性がチラホラ散見されます。感染しているのは細胞ですので、培地の交換や滅菌しても意味はなく、マイコプラズマに有効な抗生物質で細胞を処理して除去するしかありません。 培地はどうやって作ってますか？血清を入れる前の培地の使用期限はいつでしょう？成分表もチェックしましたか？ ごくたまーにですが、インキュベーターや周辺機器のモーターの振動に共鳴して、細胞が波紋状(何十もの輪っか状)に増殖し、綺麗にコンフルエントにならないことがあります。極端な例ですが、以下を参考に。これは出たり出なかったり、偶然の要素が強く6wellで、特定のインキュベーターの棚にだけ出る、というような出方をします。 https://can01.safelinks.protection.outlook.com/?url=https%3A%2F%2Fwww.reddit.com%2Fr%2Flabrats%2Fcomments%2F4q5g82%2Fcells_have_grown_in_a_weird_pattern_any_idea_how%2F%3Frdt%3D55795&data=05%7C02%7Cnoriko.uetani%40mcgill.ca%7Cd8ed4b5a217e41c8f81c08dd4573e2cc%7Ccd31967152e74a68afa9fcf8f89f09ea%7C0%7C0%7C638743086203643123%7CUnknown%7CTWFpbGZsb3d8eyJFbXB0eU1hcGkiOnRydWUsIlYiOiIwLjAuMDAwMCIsIlAiOiJXaW4zMiIsIkFOIjoiTWFpbCIsIldUIjoyfQ%3D%3D%7C0%7C%7C%7C&sdata=qQ7daiYWDhBm6QTeeyrEhC3nmVJ%2BYeqzS15wtZXDiYA%3D&reserved=0

(無題) 削除/引用 No.12859-20 - 2025/03/11 (火) 15:38:09 - aa 皆さんたくさんのご意見ありがとうございます。 トリプシンの影響はないのではないかと考えています。回収前、つまりトリプシンを使う前に細胞の様子がおかしくなっています。 培地もまだ20日ほどしかたっていないものを使いました。 段階を分けてうまくいっている人に補助してもらいながらやってみるのも指導教官に提案してみたいと思います。ありがとうございます。 本来であればコンフルになっている時間しっかりおいてから顕微鏡で観察していますので時間の問題はないです。

(無題) 削除/引用 No.12859-19 - 2025/03/11 (火) 15:25:38 - あの 念のためですが、細胞をまいてから顕微鏡観察するまでの時間が短すぎるということはないですね？　通常は、まいた翌日は、いっさいの振動を与えない方がよいです。

(無題) 削除/引用 No.12859-18 - 2025/03/11 (火) 03:43:02 - SN 上手く出来ている人から、色んな段階で分けてもらったらどうですか？ 1)薬剤まで調整してもらって、それを細胞に添加するだけ 2)細胞をプレートにまいてもらって、薬剤から調整 3）フラスコを分けてもらって、細胞の播種から調整 うまくいっている人に対照として一緒にやってもらえると良いかも。

(無題) 削除/引用 No.12859-17 - 2025/03/11 (火) 03:20:43 - おお あと影響が出そうなものはトリプシン処理の加減（単純に時間だけで処理の加減を見極めれないので要注意）。無血清培地を使っているならちゃんと抜けているか、遠心の強さ、ピペッティングの強さなど物理的な過剰な刺激など。

(無題) 削除/引用 No.12859-16 - 2025/03/11 (火) 01:41:20 - mont 培地中のL-グルタミンは光分解しやすく、保存中に徐々に分解し、細胞毒性のある分解物になるのだそうです。なので、冷暗所保存で、期限内に使い切るように注意しています。あるいは、あまり沢山使う予定のない培地の場合などは、最初からL-グルタミン無しの培地を購入し、使う前に分解しにくいグルタマックスを加えて使っています。 もし古い培地を使っているなら、もしかしたら、、、と思いましたのでお知らせします。 以下参考までに https://www.thermofisher.com/ca/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/media-supplements/glutamax-media.html?gclid=Cj0KCQjwm7q-BhDRARIsACD6-fVrOUsuCdlnDsjb0-GOR7ms_sV4zz3w1FnFYqsm5Hnd2eRN22V5CAMaAuPuEALw_wcB&ef_id=Cj0KCQjwm7q-BhDRARIsACD6-fVrOUsuCdlnDsjb0-GOR7ms_sV4zz3w1FnFYqsm5Hnd2eRN22V5CAMaAuPuEALw_wcB:G:s&s_kwcid=AL!3652!3!733018704366!e!!g!!glutamax!1759362861!66460962701&cid=bid_clb_cce_r01_co_cp0000_pjt0000_bid00000_0se_gaw_bt_pur_con&gad_source=1

(無題) 削除/引用 No.12859-15 - 2025/03/10 (月) 16:15:36 - aa 薬剤なしのコントロールもとっていますが、同じような結果になります。 何度か見せてもらい、また見てもらうことも行っておりますが何が原因かわからない状態です。すごく小さなことが原因の可能性もあると指導教官とも相談しており餡巣。

(無題) 削除/引用 No.12859-14 - 2025/03/08 (土) 14:45:20 - おお 薬剤の影響が強く出てそうな気もしなくもないけど、、、薬剤なしのコントロールは取らないのでしょうか｡ 何か気付けないところで他の人と違うことをしてしまっている可能性があるのでしょう｡そう言うのは直接見れない人が色々発想を豊かにして指摘しても外れている方が多いと思われます｡ 上手くいっている人がいるなら一度やっているところを一部始終見せてもらうとか、観ながら同時に自分でもやってみて違いを見つける、あるいは見つけてもらうなりした方がいいです｡それか、やっているところを見てもらうか。

(無題) 削除/引用 No.12859-13 - 2025/03/08 (土) 13:40:37 - aa 6well plateで播種後24時間後に培地交換による薬剤添加を行います。 アスピレートで吸いすぎているわけではないことは確認しています。 薬剤添加する前は正常に育っているように思えますが、薬剤添加すると細胞が丸くなっているように見えます。 グルタミンは培地に含まれていることは把握してます。 同じ細胞を分け、培地の組成も全く同じもの、プレートも同じものを使用している人はうまくいくのです。薬剤も同じものを他の人が使うと上手くいきます。

(無題) 削除/引用 No.12859-12 - 2025/03/07 (金) 12:37:30 - gdtm 以前消耗品を別メーカーにしたところ、細胞増殖が悪化するケースが有りました。 ガンマ線の当て過ぎなど異物の混入によるものかと思います。 消耗品の品番など変わっていないかチェックしてみてください。 あとは、細胞自体がヘタっているなら新たに解凍した方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12859-11 - 2025/03/07 (金) 03:36:15 - おお 培地なんですが、その実験でまくときにグルタミン不含の培地をそのまま使っているとかないでしょうか？グルタミンは培養細胞ではとくにATP合成をグルタミンに依存していることがおおく、大抵の場合グルタミン不含の培地にグルタミンを入れ忘れるとまいたあとに徐々に増えなくなって来ます。

(無題) 削除/引用 No.12859-10 - 2025/03/06 (木) 20:34:07 - re 播種後、一旦は普通に接着して伸展もするけど、数日後に見るといつの間にか剥がれてる（死んでる）という感じですか。それとも播種後の接着、伸展からしてイマイチ遅いという感じなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.12859-9 - 2025/03/06 (木) 12:02:35 - aa ご指摘いただきありがとうございます。 プレート側の問題もあり得るというところは盲点でした。 確認します。 プロトコールをどの段階まで開示していいのかが判断できないため、あやふやな質問となり申し訳ありません。 全く同じ条件で別の人が行った場合には私のような細胞の状態にはならずうまくいっているため、条件やプレートの問題はないのではと考えています。 手技的なところも何度も確認を行っていただいているのですがこれといった問題点がなく困り果てております。

(無題) 削除/引用 No.12859-8 - 2025/03/05 (水) 16:30:07 - LPS 単純ですが、十分な量の培地を使ってますか

(無題) 削除/引用 No.12859-7 - 2025/03/05 (水) 13:31:45 - おお 昔ラボにtissue culture 用の処理をしてないプレートが混じってなんだか増えるけど剥がれていくと言う事がありました｡ 他の実験では問題がなかったと言うのは培養の条件が違うからと言う事なのでしょうか？それならある程度実験のプロとコールを開示しないと的を得たアドバイスが提示されない可能性はないですか？

(無題) 削除/引用 No.12859-6 - 2025/03/05 (水) 12:16:08 - re 6 wellプレートを他社製品に変えてみたらどうでしょうか。直接でも代理店経由でもいいので無料サンプルを1,2枚お願いして試してみるなどできると思います。

(無題) 削除/引用 No.12859-5 - 2025/03/05 (水) 11:24:01 - aa 6well plateでもインキュベート時間が短い実験は問題ないです。ある一つの実験を行った際だけコンフルになりません。

(無題) 削除/引用 No.12859-4 - 2025/03/05 (水) 11:22:37 - aa コメントいただきありがとうございます。 接着は強い細胞ではないですが弱すぎるといったことはありません。 培地はフェノールレッド不含のものを用いていますが、培地の色に明らかに変化があるようなことはありません。 マイコプラズマ感染についてですがフラスコで培養しているときは正常に増殖し、また、同じ細胞を使って他の実験を行った際は何の問題もありません。 6well plateにした時だけどうしてもうまくいかないのです。

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