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(無題) 削除/引用 No.12851-7 - 2025/02/25 (火) 01:47:33 - おお >推奨テンプレート量はプラスミドの方が多くなっていると思いますが、これはなんででしょうか？ コピー数換算だからです。

(無題) 削除/引用 No.12851-6 - 2025/02/24 (月) 19:00:32 - はんちく > リニアなDNAの方がテンプレートとしての利用率が高いとかあるんですかね？ それはそうでしょう。covalently closed circularなら、複製フォークは途中までしか進まないはず。nicked moleculeだけが鋳型になっているのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.12851-5 - 2025/02/24 (月) 15:34:36 - 774R ＞推奨テンプレート量はプラスミドの方が多くなっていると思いますが、これはなんででしょうか？ 単純に分子の数が一定範囲になるようにするためだと思います。 私がよく利用するGeneWizのガイドラインによると4kb以上はプラスミドと同じテンプレート量として扱うことになっています。 とはいえ、4kb以下で比べるとPCR産物の方が分子数で見ても少ないですね。リニアなDNAの方がテンプレートとしての利用率が高いとかあるんですかね？

(無題) 削除/引用 No.12851-4 - 2025/02/24 (月) 12:26:58 - ヨーカドー おおさん、774Rさん 確かに外注するときれいに読めるんです。なので、方法がなにかおかしいのだと思います。 うちではBigDyeを16倍に希釈して、かつ液量もトータル10uLでやっていますがこれが関係しているのでしょうか？ あと、推奨テンプレート量はプラスミドの方が多くなっていると思いますが、これはなんででしょうか？ 質問ばかりですみません。よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.12851-3 - 2025/02/23 (日) 16:40:49 - 774R 配列が特殊とかですか？ そうではなく、配列に関わらず毎回そうだとすると、プラスミドの調整かシーケンスの手技に問題があるのだと思います。 まあPCR産物の方がDNAへのダメージも不純物も少なさそうなので、失敗のしようがないといったところでしょうか。 当方、シーケンスは外注ですが、プラスミドで常時900bp程度までエラーなく読めてます。

(無題) 削除/引用 No.12851-2 - 2025/02/23 (日) 16:13:55 - おお >PCR産物をそのまま読む場合はきれいに読めることが多いですが、プラスミドの場合はきれいに読めなかったり、リードが短くなることが多い 個人的にはそうでもないと思ってますが、、、

プラスミドのシークエンス 削除/引用 No.12851-1 - 2025/02/23 (日) 14:58:39 - ヨーカドー サンガーシークエンスをするときに、PCR産物をそのまま読む場合はきれいに読めることが多いですが、プラスミドの場合はきれいに読めなかったり、リードが短くなることが多いのはなんででしょうか？ ターゲットの大きさが5-6kbpと大きめでもダイレクトシークエンスの場合はきれいに読めます。 プラスミドの構造（環状とか）の問題なのでしょうか？それとも大腸菌で増えるときに修飾されているからなのでしょうか？

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