BioTechnicalフォーラム [タンパク質を濃く抽出する方法]

タンパク質を濃く抽出する方法

No.12845-TOPIC - 2025/02/19 (水) 16:32:40 - ルパン三世

マウスの全身の組織からタンパク質抽出を試みています。
RIPA bufferを使用して、タンパク質回収を行っているのですが、濃く回収することができません。
以下に方法を示します。

・解剖を行い、目的の組織・臓器を取り出す。
・組織・臓器を1.5mlチューブへ入れる。
・ice boxで1.5mlチューブを保管する。この先、チューブはできるだけ氷上で扱うようにする。
・RIPA bufferを組織が十分浸かる量入れる。（200~300 ul 程度
・ホモジナイザーで、組織を断片が見えなくなるまで砕く。作業中、しばしばチューブを氷上に戻し、チューブを冷やしながら行うこと。
・15,000 rpm, 4℃, 30 min 遠心する。遠心機が4℃に冷えるまで待ってから行うこと。
・上澄みを新しい1.5mlチューブに分注する。

濃くタンパク質を回収するためにはどのようにすればよいでしょうか。
ご教授お願い致します。
　

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No.12845-6 - 2025/02/20 (木) 00:28:23 - おお

>通常は10%ホモジネート（目分量で組織体積：lysis buffer体積=1:9くらい）

そうですよね。私もそれぐらいが目安かなと。
組織重量を測っておいて1mgに対して100ulくらいで1ug/ug とWBとかで使いやすそうな濃度になると言う感覚。これより2倍程度濃くてもいいけど、それ以上濃いと抽出効率が悪くなると思う｡

> RIPA bufferを組織が十分浸かる量入れる。（200~300 ul 程度
って書いてるので「目分量で組織体積：lysis buffer体積=1:1くらい」に思える。

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No.12845-5 - 2025/02/19 (水) 22:13:22 - 2

一番簡単なのは液量を減らす、というかおおよその組織容量：lysis buffer量の比率を変える。通常は10%ホモジネート（目分量で組織体積：lysis buffer体積=1:9くらい）を基本にして必要に応じて比率を適宜変えながらやってますが、タンパク質濃度（組織により異なるが、この比率でもやや高いすぎて、後で希釈することもある。5%ホモジネートくらいにすることもある。）も含めていい感じで支障なくできてます。

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No.12845-4 - 2025/02/19 (水) 22:05:55 - あの

凍結粉砕や、超音波で処理するのはどうですか？

凍結粉砕は色々方法がありますが、液体窒素と乳鉢使うと安いです。
超音波は、超音波洗浄機を流用できます。

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No.12845-3 - 2025/02/19 (水) 17:28:07 - おお

For 5 mg tissue, add 300 µL of ice-cold lysis buffer and homogenize using electric homogenizer. Add additional 300-600 µL of lysis buffer during homogenization.

https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technical-documents/protocol/protein-biology/western-blotting/sample-preparation#:~:text=Extraction%20of%20proteins%20from%20tissues,and%20homogenize%20using%20electric%20homogenizer.

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No.12845-2 - 2025/02/19 (水) 17:21:18 - おお

濃くって言うけど具体的にお願いします。チューブに入れた組織はどれくらいの量ですか？と言うか組織と同じぐらいの容量のRIPAという事はRIPAの量が少なすぎると思います。それが原因で完全に抽出できてないのでは？