>[Re:4] EXさんは書きました :
>
> >おおさま
> >あなたの膜タンパクの5‘に余分なアミノ酸配列をつけていいのですか？
> N末端がシグナル配列として切り出されるため、5'側への余分なアミノ酸配列の追加は難しいです。
５’がわに８０塩基ということだったのでタグか何かを融合蛋白として発現するのかと思った次第です。そうではなくUTRとして挿入するのですね。
WBはHRPを使った場合、定量性において完璧ではないです。同一メンブレンで比較すれば比較は可能ですが、Loadingがぶれた場合（蛋白定量のぶれとかで）、Internal controlとかゲル状のTotal proteinsで補正できなくもないですが、完璧な方法ではありません。
もう少し定量性を確実にするなら蛍光ラベルした抗体（一次抗体直接か二次抗体）がベターかも知れません。最近のWBなどのImagerは蛍光も使えるのが多くなってますので検出できるものを探してみるのもいいでしょう。専用の蛍光スキャナーを売っているメーカーもあります。ただ検出感度はHRPまではいかないのではと思ってます。スキャナータイプならほぼコンタクトした状態で検出するので感度は稼げますが、実際の検出感度については私はよくわかりません。
＞リポフェクタミン2000、3000、fugene HD、確かに覚えがあり、
まあよく使われる試薬ではあります。ただ各社色々出してますので、最近の文献であなたが使う細胞で何が使われているか複数の文献を調べてみてもいいかなとおもいます。PEIをつかった試薬もポピュラーになっているようですし、試薬屋もどの細胞でどれくらい入るとかデーターベースを作っていることもあります。
AAVやレンチもそれなりに使われるようになってきてます。レンチとかあなたの実験では使いやすいかもしれません。
あとエレクトロポレーションもいろいろと良さげなシステむが出てきているようです。 |
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