BioTechnicalフォーラム [SDS-PAGEがうまくいかない。]

SDS-PAGEがうまくいかない。

No.12830-TOPIC - 2025/02/09 (日) 16:11:56 - やまもと

10%アクリルアミドゲルをAPS、TEMED、アクリルアミド、SDSを用いて作製しました。組織から抽出したトータルタンパク質をアセトン沈殿法で精製し1xSDSバッファー（Tris, SDS, DTT, Glycerol, BPBを含む）に溶解しました。DC assayにより定量した後、同じく1xSDSバッファーで目的のタンパク量（35 μg）まで希釈し、95℃で5分以上加熱変性を行っています。
ウェルにタンパク質をロードし、泳動後にCBB染色を実施しました。しかし、脱色操作に移るとゲルの上部（泳動が進んだ範囲）までは均一に青く染まるものの、それより下の部分は透明な状態でした。さらに脱色を進めると、マーカーは鮮明に確認できるようになっていきましたが、組織由来のタンパク質バンドは一切検出されません。同じようなご経験のあるかた、または原因として考えられるものがあれば教えていただけませんでしょうか。
何か他に追加で記載すべき情報があればお知らせください。よろしくお願いいたします。
　

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No.12830-12 - 2025/02/10 (月) 16:05:23 - やまもと

>>qq様、み様、おお様
ご指摘ありがとうございます。
ご指摘いただいた点につきまして再度実験をいたしました。
結論から申し上げますとDC assay時にDTTを含むbufferを使ってしまっていたため、タンパク量の過大評価をしていた、というのがうまくいかなかった原因でした。
タンパクを >>み様のご提案のbufferにて抽出し再度泳動、CBB染色で今までと同様のバンドが無事確認できました。

ご回答いただいた皆様誠にありがとうございました。

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No.12830-11 - 2025/02/10 (月) 11:23:19 - ７８

「ゲルの上部までは均一に青く染まる」というのはタンパク質を泳動したレーンのみがそうなるということですか、それともゲル全体として上半分が青く染まるということですか。

35μgというのは１レーンあたりにアプライしたタンパク質量が35μgという意味でしょうか。
もしもそうならばラージゲルならば妥当かもしれませんが、ミニゲルだと多すぎと思います。

(無題)

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No.12830-10 - 2025/02/10 (月) 05:40:28 - おお

なので、どれくらいの量の組織を使ってどれくらいの収量と見積もられたのか確認してみるといいかもしれません。また実際だいたいどれくらいの収量になるのかはググったりすると出てくると思います。目安として１gあれば１００mgぐらいと言うのを念頭に入れてバッファー量を調整しています（組織によりけりだと思いますがこれより少ない組織も多いと思いますし、筋組織だったらもっと多いかもしれません）。

https://www.thermofisher.com/us/en/home/technical-resources/research-tools/image-gallery/image-gallery-detail.76920.html

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No.12830-9 - 2025/02/10 (月) 04:33:52 - おお

多分タンパク定量に問題があると思う｡DTTが反応して実際より相当高く見積もられていると思われる。

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No.12830-8 - 2025/02/09 (日) 23:00:27 - み

連投になってすみません。
qqさんの定量時のブランクを正しくとらないと蛋白による発色でなくDTTなど定量試薬に干渉する試薬による呈色反応をみている説は支持します。たぶんそれが原因で蛋白濃度を過大評価し、ボイルされたサンプルには殆んど蛋白が含まれていないほど薄いのでは。

慣れない人にはそのような危険性のあるsample bufferでの抽出ではなく、単純なNP40やTx100などによる抽出をお勧めします。

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No.12830-7 - 2025/02/09 (日) 22:49:54 - み

最初の組織からの抽出条件を書いて下さい。
ちなみにトリスバッファーに1%のNP40またはTx100を入れておけば、取り敢えずアクチンは出ます。
あなたの本来の標的蛋白が適切に抽出される条件は知り得ませんが蛋白種の情報を記載していただければ多くの人は提示してくれます。
組織重量の10倍ボリュームくらいでミキサーやソニケーション、ホモジナイザーのどれかで破砕しましょう。
その抽出した時点で定量して下さい。
アセトン沈殿なんて必要ありません。
定量後に適当な蛋白濃度になるように2xまたは4xSDS sample bufferと混ぜてボイルしたら良いです。もちろんsample bufferに含まれるSDS,還元剤,glycerolなどの濃度が最終的に1xの濃度になっていれば大丈夫です。多少濃くても薄めになっていても大概問題起こりません。蒸留水、sample buffer、蛋白抽出物の3溶液を適切に混ぜ合わせて、蛋白濃度とsamplebuffer濃度を調整します。
大概1-3mg/mlになるようにボイルしておけば、10ulゲルにアプライすれば10-30ugロードしたことになりますよね。
泳動とトランスファーは問題ないのではないでしょうか。マーカーが泳動されて膜に転写されているようですから。
1枚のゲルの左半分をCBB、右半分をウェスタンに進めば労力少なくできますよね。
CBBでバンド出ない時点でウェスタンの方も廃棄ですね。

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No.12830-6 - 2025/02/09 (日) 21:40:48 - qq

>組織から抽出したトータルタンパク質をアセトン沈殿法で精製し1xSDSバッファー（Tris, SDS, DTT, Glycerol, BPBを含む）に溶解しました。
>DC assayにより定量した後、
DC Assayそのものは還元剤に感受性ですから、そこは大丈夫なのでしょうか？
タンパク定量した結果では、それなりにたくさんのタンパクがあったようですが、組織なしで同様に抽出・精製し、１ｘSDSバッファーに溶解したものも定量されることをお勧めします。
BPBはタンパク定量の前に入れておく必要はないですよね。
DTTは、50mM程度入っているのではないかと思いますが、これではDC AssayでDTTを測定しているようなものだろうと邪推してしまいます、
DTTもタンパク定量後に入れたいところです。

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No.12830-5 - 2025/02/09 (日) 21:37:18 - やまもと

>>あの様
ご確認ありがとうございます。
電気泳動の際は125V 40mAで70-80分ほど泳動を行っております。
ゲルの大きさはXCell SureLock Mini-Cellを使用しておりまして、8ｘ8cmほどです。半年前に別の実験で行った際は問題なくできておりました。
マーカーはプレシジョン Plus プロテイン & Western スタンダードを使用しており、泳動中分離している様子、そしてブロッティングで転写されていることも確認しております。しかしβアクチンすら検出できない状況です（ゲルのCBB染色で検出すらできていないので当たり前でしょうが…）

>>78様
ご指摘ありがとうございます。
試薬を取り違えている、pHの問題などはあり得るかもしれません。半年ぶりに新しい組織から抽出したタンパクで実施したところ、うまくいかなかったため一度試薬を作り直したのですが、そこでさらにエラーが起きたこともありうるかもしれません。取り違えや勘違いをしていないか、チェックしてみようと思います。マーカーの分離パターンに問題はなさそうでした。

(無題)

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No.12830-3 - 2025/02/09 (日) 20:16:24 - ７８

濃縮ゲルのTris-HCl buffer(pH6.7)と分離ゲルのTris-HCl buffer(pH8.8)を取り違えていませんか？逆にしてるとそういう感じになるかもしれません。マーカーの分離パタンは製品添付のマーカーの写真と同じような感じですか？。
またRunning bufferの組成は間違いないでしょうか。10x(or x1)を1x(or x10)と勘違いして、とかはないですか？

(無題)

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No.12830-2 - 2025/02/09 (日) 18:34:43 - あの

電気泳動の際の電源の設定はどうですか？

定電圧か定電流か？　設定した値は(何ボルトかなど)？　
泳動した時間やゲルの大きさは？

なお泳動がうまくいっているか、進行状況を見れるので、あらかじめカラー付きの分子量マーカーの使用を推進します。

SDS-PAGEがうまくいかない。

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No.12830-1 - 2025/02/09 (日) 16:11:56 - やまもと

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