BioTechnicalフォーラム [酵素が発現できなくて悩んでいます。]

酵素が発現できなくて悩んでいます。

No.12818-TOPIC - 2025/02/04 (火) 16:41:02 - koso

いつもお世話になっております。

pETベクター系でBL21(DE3)に導入したタンパク質を発現しようとしているのですが上手くいきません。
原因は前培養や本培養うんぬんではなく、菌体自体にありそうだということが分かりました。しかし、具体的に何がいけないのかは分かりません。

一次スクリーニングで多数取れてきた菌体をLB培地に植菌して保存しています。以前、長期間培地で保存するとプラスミドが抜け落ちてしまうと聞きました。しかし、前培養で液体培地に植菌した際に生えてくるということはAmp耐性がある＝プラスミドが入っているということだと思っているのですが。。。

これまでに同じような経験をした方いらっしゃいましたらご教示お願いいたします。
　

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No.12818-11 - 2025/02/15 (土) 21:14:21 - koso

>[Re:7] おおさんは書きました :
> 私はたいていは蛋白を作るときにまず線画培養などでシングルのコロニーをいくつか拾ってそこから始めます。グリセロールストックなどが顕著ですがチューブごととか一部をかき取って直に増やすと、増えはしても発現がストック前より極端に弱くなったりします。あんまり具体的に何が起こっているか説明できませんが、不要な配列がストレスなどによる組み換えなどで排除されているのではと思ってます。これは単にプラスミドを保存しているストックでも起こります。精製してみたら説明がつかないプラスミドが取れたり、場合によっては耐性を持っているのにプラスミドが取れなかったり。

返信が遅れてしまい申し訳ありません。
おおさんの体験談をお聞きし、とても考えさせられました。

IPTGが原因でもないし、振盪機の調子が悪いわけでもないし、、、
現在も何が起きているか全く見当もつかない状態なので、グリストからシングルコロニーを拾って、という手順を踏んでもう一度トライしてみます。

貴重なご意見ありがとうございました。

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No.12818-10 - 2025/02/15 (土) 21:08:41 - koso

>[Re:8] 老兵さんは書きました :
> この場合の一次スクリーニングとは何を基準にしたスクリーニングですか。

返信が遅くなってしまって申し訳ございません。
一次スクリーニングはTLC分析のことを指しておりました。

当方の実験では、まず酵素にEP-PCRでランダムな変異導入を行い、変異体ライブラリを作製します。そこから爪楊枝でコロニーをつついて菌体反応を行い、TLC分析にかけて陽性変異体を探索してきます。しかし、TLCの精度がそれほど高くないのでHPLC分析で二次スクリーニングを行うという流れになっています。

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No.12818-9 - 2025/02/05 (水) 15:15:34 - 774R

確かに、私も1次スクリーニングが何を意味してるのか謎でした。
普通はコロニーから液体培養し、プラスミド精製した後、制限酵素パターンやシーケンスで当たりクローンを確定するわけで、1次も2次もないですし、、、

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No.12818-8 - 2025/02/05 (水) 14:13:55 - 老兵

この場合の一次スクリーニングとは何を基準にしたスクリーニングですか。

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No.12818-7 - 2025/02/05 (水) 10:41:38 - おお

私はたいていは蛋白を作るときにまず線画培養などでシングルのコロニーをいくつか拾ってそこから始めます。グリセロールストックなどが顕著ですがチューブごととか一部をかき取って直に増やすと、増えはしても発現がストック前より極端に弱くなったりします。あんまり具体的に何が起こっているか説明できませんが、不要な配列がストレスなどによる組み換えなどで排除されているのではと思ってます。これは単にプラスミドを保存しているストックでも起こります。精製してみたら説明がつかないプラスミドが取れたり、場合によっては耐性を持っているのにプラスミドが取れなかったり。

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No.12818-6 - 2025/02/05 (水) 10:12:03 - noname

長期的に保管するのであればグリセロールストックを作製したほうが良いと思います。短期（1か月ほど）でしたら、今のLBプレートでも大丈夫です。

先行研究（論文？研究室の過去の卒論？）でできているのであれば、菌株やベクターの種類、培養温度をトレースしてみるのが第一だと思います。ただ、書いていないちょっとしたコツで発現したりしなかったりするので、著者に確認するのが早いです。

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No.12818-5 - 2025/02/04 (火) 17:32:38 - koso

>プラスミドが菌の増殖に不利に働いたり、作られるタンパク質（本件では酵素？）が菌にとって毒性を発揮するならば、よくある話です。

ご連絡ありがとうございます。
先行研究からこの酵素が発現できることが示されていたので、よりいっそう謎が深まっています。

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No.12818-4 - 2025/02/04 (火) 17:29:45 - koso

>LB培地に植菌して保存という状態はどのような形態でしょうか。
液体？

ご連絡ありがとうございます。
保存に使用しているLB培地は固体です。

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No.12818-3 - 2025/02/04 (火) 17:23:29 - 774R

プラスミドが菌の増殖に不利に働いたり、作られるタンパク質（本件では酵素？）が菌にとって毒性を発揮するならば、よくある話です。