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(無題) 削除/引用 No.12817-20 - 2025/02/12 (水) 10:34:46 - Bac4 皆様 様々な情報、アドバイスをくださり誠にありがとうございます。 実際の使用者のご意見を聞くことは叶いませんでしたので、バクテリアでRT-qPCRを行っている論文のマテメソを地道に確認していこうと思います (おお様、OligodTプライマーを使用している論文を教えてくださりどうもありがとうございました)。 バクテリアでもpolyA付加が起こることは全く知りませんでした。 貴重な情報をどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12817-18 - 2025/02/08 (土) 12:21:54 - おお PMID: 15126489 これはSuperScriptでランダムプライマーをつかってます。 https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-9833-3_10#Sec5 GoScript™ Reverse Transcription Systemでランダムプライマー doi.org/10.1111/1574-6968.12447 QiagenのQuantiTect Reverse Transcriptionを使っていて 添付RT primer mixはOligodTとランダムプライマーのミックス。スーパーミックスになっていてほぼMasterMix。 doi.org/10.1038/s41598-023-38383-4 PrimeScript RTでランダムプライマーかスペシフィックプライマーを使ってるかな

(無題) 削除/引用 No.12817-17 - 2025/02/08 (土) 08:49:54 - あの ランダムプライマーしか使わなくても、ポリA付きが鋳型になるかもしれないから、PCR段階では、プライマー設計に注意が必要でしょうね。 いずれにせよ、トピ主さんの目的次第で、どういうcDNA合成系を用いるか決断する必要がありますね。 それから論文投稿後に、レフェリーから突っ込まれて、リジェクトされないように、 適切に既報をよく調べて、cDNA合成キットを選んだ理由を、M&Mの中で引用しながら説明した方がいいですね。 もしかしたら、Discussionの中でも、触れる必要もありそう。

(無題) 削除/引用 No.12817-16 - 2025/02/08 (土) 05:06:28 - おお たぶんリファレンス引いているのでわかっていらっしゃると思いますが、OligodTを使えばバクテリアでもすべてのmRNAの逆転写が起こるというわけではありません。ほとんど逆転写は起こらないだろうと思われます。 Poly AのついたmRNAは分解されるとされていますので、そのキネティクス次第では分解に進むmRNAのOver representativeの可能性とか、、、あるかなぁ、ないかなぁとか。

(無題) 削除/引用 No.12817-15 - 2025/02/07 (金) 19:25:50 - あの prokaryotes でもあるのですね。　 https://royalsocietypublishing.org/doi/10.1098/rstb.2018.0166

(無題) 削除/引用 No.12817-14 - 2025/02/07 (金) 18:11:20 - おお バクテリアもpolyadenylationが起こりますけどね。

(無題) 削除/引用 No.12817-13 - 2025/02/07 (金) 12:49:36 - oligo すみません。 ×AT rich ○AU rich です。

(無題) 削除/引用 No.12817-12 - 2025/02/07 (金) 12:48:23 - oligo AT richな配列をもつRNAがover-representedになる可能性を危惧しましたが、野生株とmutantの比較であれば問題ないように思います。

(無題) 削除/引用 No.12817-11 - 2025/02/07 (金) 11:32:40 - おお バクテリアのRTqPCRをした論文とかあたってみるといいかもですね。使ったキット（Master mixとか）とか書いているだろうから。それでOligodTがはいったPre-mixとか使っているのがそれなりにあるならあまり気にしなくてもいいのかもです。あるいはRT用のプライマーが入ってないMaster MixとかランダムプライマーだけのMasterMix使っていたら使えそうなものが見つかるだろうし。

(無題) 削除/引用 No.12817-10 - 2025/02/07 (金) 11:03:11 - Bac4 >[Re:9] oligoさんは書きました : > 使用目的は何ですか？ > 定量的な解析に使うのは良くない気がします。 oligo様 ご返事をどうもありがとうございます。 目的は定量PCRになります (SYBR GreenでのリアルタイムPCR) 野生型株とmutantにおける、ある遺伝子の発現レベルの比較が目的です。 定量的な解析に用いる上でどのような点が懸念されますでしょうか。 ぜひ教えていただけますと嬉しく思います。 >[Re:8] あのさんは書きました : > 単なる思いつきですが、オリゴdTの入ったマスターミックスに、ランダムプライマーを追加して使うってのはどうでしょうか？ > > オリゴdTが入っている分、ランダムプライマーは減らしているというのはありえそうですから。 > > それから、案外メーカーに事情を説明して、聞けば、オリゴdTやランダムプライマーの添加量を教えてくれるのではないかと思います。 あの様 それはアリかもしれません。 実は本トピックに関してはここに投稿する前にメーカーの方に問い合わせておりまして (そのような使い方をしたことはないのでわからないとのご回答でした)、プライマーの比率に関しても重ねて問い合わせてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.12817-9 - 2025/02/07 (金) 08:39:39 - oligo 使用目的は何ですか？ 定量的な解析に使うのは良くない気がします。

(無題) 削除/引用 No.12817-8 - 2025/02/07 (金) 02:49:51 - あの 単なる思いつきですが、オリゴdTの入ったマスターミックスに、ランダムプライマーを追加して使うってのはどうでしょうか？ オリゴdTが入っている分、ランダムプライマーは減らしているというのはありえそうですから。 それから、案外メーカーに事情を説明して、聞けば、オリゴdTやランダムプライマーの添加量を教えてくれるのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.12817-7 - 2025/02/06 (木) 21:39:06 - あの そういえば、バラのキットでも、混ぜてしまってから保存して再使用するという話題が、たしか去年あったと思います。

(無題) 削除/引用 No.12817-6 - 2025/02/06 (木) 15:42:07 - Bac4 おお様 早速のお返事どうもありがとうございます。 確かにどちらも私が希望するようなバッファー構成になっているようです。 NEBのキットの方はコスト的にも優れているようですので、乗り換え可能かどうか検討しようとお思います。

(無題) 削除/引用 No.12817-5 - 2025/02/06 (木) 12:47:11 - おお https://www.promega.com/products/pcr/rt-pcr/goscript-reverse-transcriptase/?tabset0=2&catNum=A2801 https://www.neb.com/en-us/products/e3025-lunascript-rt-master-mix-kit-primer-free?srsltid=AfmBOoqvmQ-rQNr6K3Xc-0muxGuWuhB6EU98cDPuXsvUK1SGDJFC9xqZ あとは SuperScript™ III First-Strand Synthesis SuperMix はBuffer MixにすでにdNTPが入っていて簡略化されてますね。

(無題) 削除/引用 No.12817-4 - 2025/02/06 (木) 11:22:56 - Bac4 >[Re:3] あのさんは書きました : > オリゴdT入っていても、問題ないのではないかと想像している。たぶんcDNA合成後はPCRでしょうし。 > > > なお当方は、マスターミックスタイプでない、バラのキットの方が、消費期限が長いので好きです。ピペット作業って言っても、一度、混合液を作って分注するなら、増える作業量はわずかだから。 あの様 お返事どうもありがとうございます。 こちらも同様の考えなのですが、マスターミックスプライマーのoligodTとランダムプライマーの比率が不明であるなどいくつか気掛かりな点もあり、使用歴のある方がいれば感触をお聞きしたいと思っておりました。 バラのキットの方が消費期限が長いというのは知りませんでした。貴重な情報をどうもありがとうございます。私も自分でやる場合には混合液を作って分注する派なのですが、学生のリキッドハンドリング精度が芳しくないため、ステップを一つでも減らしたいという事情があります。 >[Re:2] おおさんは書きました : > プライマーが入ってないマスターミックスを売っているところも見かけるので探してみればと思いますが｡ > > マスターミックスじゃない、酵素とバッファーを買えばどうですか？ > https://lifescience.toyobo.co.jp/detail/detail.php?product_detail_id=151 おお様 お返事どうもありがとうございます。 私の情報収集不足もあり、プライマーが入ってないマスターミックスを見つけられていない状況です。 (キャンペーン期間で割安で購入できるのでTAKARAとTOYOBOで探しておりました。現在はSuperScriptを使用しています。) 差し支えなければ、そのようなキットを販売しているメーカー様をご教示いただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.12817-3 - 2025/02/06 (木) 03:01:51 - あの オリゴdT入っていても、問題ないのではないかと想像している。たぶんcDNA合成後はPCRでしょうし。 なお当方は、マスターミックスタイプでない、バラのキットの方が、消費期限が長いので好きです。ピペット作業って言っても、一度、混合液を作って分注するなら、増える作業量はわずかだから。

(無題) 削除/引用 No.12817-2 - 2025/02/06 (木) 00:06:21 - おお プライマーが入ってないマスターミックスを売っているところも見かけるので探してみればと思いますが｡ マスターミックスじゃない、酵素とバッファーを買えばどうですか？ https://lifescience.toyobo.co.jp/detail/detail.php?product_detail_id=151

OligodTが混入したプライマーミックスを利用した細菌RNAの逆転写 削除/引用 No.12817-1 - 2025/02/03 (月) 17:18:43 - Bac4 バクテリアRNAの逆転写におすすめの試薬を探しています。 実験時になるべくリキッドハンドリングのステップを減らしたく、マスターミックスと鋳型を混ぜるだけのものがないか探していると、東洋紡のReverTra Ace® qPCR RT Master Mixという製品を見つけました。 ただこのキット、プライマーにランダムプライマーとoligodTの混合物がマスターミックスに入っているようで、バクテリアRNAの逆転写にそのまま使用して良いものか気になっています。 本製品もしくは同様のキットを利用したことがある方がいらっしゃいましたら、この点教えていただけますと幸いです。 また、この製品以外にもおすすめの逆転写キットがありましたらぜひ書き込んでいただけますと幸いです。 （価格、操作のシンプルさを重視しております）

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