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(無題) 削除/引用 No.12815-10 - 2025/02/08 (土) 05:31:16 - おお >[Re:4] おおさんは書きました : > >[Re:3] mtaさんは書きました : > > 16℃は一般的なのでしょうか？ > > 私は基本は30℃で行い、発現が見られないケースの時は34などにあげます。 > > 16℃はコンピ作製では昔していましたがタンパク誘導でそれは私は聞いたことがないです。 > > そう言う方法はあります。 その逆も真なりで、ヒートショック蛋白の誘導と影響を期待して４０度ぐらいで誘導するとか言う方法もありますね。

(無題) 削除/引用 No.12815-9 - 2025/02/08 (土) 05:27:36 - おお 発現は全く見られないということですが、CBB染色で特異的バンドが見れないということでしょうか？ そういうことはしょっちゅうですね。それでもアフィニティーにかけるとものが取れてきたりします。生化学的な実験やるなら一回数十ナノグラム程度で済むことが多いので培養スケールを１Lとかあげれるだけ上げて精製することはまあまああります。比較対象のリコンビナントがCBBで確認できるほど多いのであれば、両者の精製度の違いは意識したほうがいいですね。違うアフィニティーやイオン交換、あるいはゲルろ過などでもう１ステップ精製プロセスを踏むとか。

(無題) 削除/引用 No.12815-8 - 2025/02/07 (金) 17:34:47 - noname TB培地だとだめで、LB培地だと発現するというのに当たったことがあるので、変えてみるのもありかと思います。 その時はプラスミドのコピー数がTBだと激減するのが要因っぽかったです。

(無題) 削除/引用 No.12815-7 - 2025/02/07 (金) 17:21:22 - ぜあ みなさま ありがとうございました。 中々複雑で難しそうですね…ほぼほぼ全く発現しない現状ですので、Drasticな変化に期待したいところですが、そうなるとタグ挿入なのでしょうか。コドン最適化は以前別のタンパクで試したことがあるのですが、発現量が99%以上低下してしまった経験があり、あまり芳しくない結果に終わってしまいました… (IPTGは、ポジコンで生きてることを確認しております) タグについては全くの無知でしたので、勉強になりました、ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.12815-6 - 2025/02/06 (木) 07:29:46 - たこ あ、あとまさかとは思うけど、IPTG死んでないですよね？ １度あったので念のため。

(無題) 削除/引用 No.12815-5 - 2025/02/06 (木) 02:53:50 - たこ BL21(DE3)からRosetta 系にかえて発現が改善したことはありますが、drasticに変わったわけでもなく、根本的解決にはならなかった経験がいくつかのコンストラクトであります。 あと、おおさんの仰るように、タグをつけていいならpET43, 50系のNusAやら、SUMOをN末につけるのも１つの手だと思います。 現在進行形でそれを使ってますが、ばちくそ発現が上がって、結晶化にも余裕で持っていけるレベルの量が200 ml 程度でとれました(途中の透析等でかなり凝集したにもかかわらず)。 HRV3Cの配列がタグ下流についてたからそれで切れると思うけど、ものによってsteric hindranceが出てくることもあるので要注意です。 そのばあいGGGGSx5のリンカーをタグと3C配列の間に噛ませたらがっつり切れた経験もあります。 ほかにはお作法的にコドン最適化でしょうかね？

(無題) 削除/引用 No.12815-4 - 2025/02/05 (水) 23:37:21 - おお >[Re:3] mtaさんは書きました : > 16℃は一般的なのでしょうか？ > 私は基本は30℃で行い、発現が見られないケースの時は34などにあげます。 > 16℃はコンピ作製では昔していましたがタンパク誘導でそれは私は聞いたことがないです。 そう言う方法はあります。

(無題) 削除/引用 No.12815-3 - 2025/02/05 (水) 20:44:00 - mta 16℃は一般的なのでしょうか？ 私は基本は30℃で行い、発現が見られないケースの時は34などにあげます。 16℃はコンピ作製では昔していましたがタンパク誘導でそれは私は聞いたことがないです。

(無題) 削除/引用 No.12815-2 - 2025/02/05 (水) 11:01:46 - おお 培養条件やホストを変えてドラスティックに行った経験はありません。劇的に発現できるようなコンディションが見つからないとまでは言いませんが（たまにそういう論文があるので）、徒労に終わることも多いと思ってます。 量にもよるけど無細胞系でだと大腸菌の顔色を伺うこともないのでうまくいくことが多いと聞きます。 ＞pETプラスミドDNA 培養条件とかよりもコンストラクトをいじったほうが可能性が高そうではあります。タグやその間にスペーサーをちょっとおいてやるとか。

大腸菌発現系IPTG誘導のトラブルシューティング 削除/引用 No.12815-1 - 2025/01/31 (金) 17:55:15 - ぜあ 当方，タンパク発現については初心者です． 現在，あるタンパク質の大腸菌発現系を構築しようとしているのですが，上手く発現してくれずに困っております（SDS-PAGE及び活性測定より判断）． 封入体を変性させたものについても，SDS-PAGEからは目的タンパク質のバンドが得られませんでした． アミノ酸配列が６０％程度相同性のある別のタンパク質では，既にIPTG誘導による発現に成功した経験があり，プロトコルを流用したのですが，ほぼ全く発現しません．現在，pETプラスミドDNA，宿主としてBL21 DE3コンピテントセルを用いておりますが，これらを変えることで飛躍的な発現量向上は期待できますかね．．．？ プロトコル詳細（相同性の高い別のタンパクでは発現成功） ーーーーーーー 宿主　BL21 （DE3）コンピテントセル 培地　TB培地 前培養を３７℃で行い，OD600＝0.8のタイミングでIPTG添加（0.4 mM）． １６℃で約１８時間培養． ーーーーーーー よろしくお願いいたしますｍ（＿ ＿）ｍ

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